随着医学的深入研究和经验的积累，在癌症的治疗方面，尽管外科手术，放疗，化疗等传统的治疗方式取得了长足的进步，然而治疗效果仍不尽人意。近十年来肿瘤学的生物靶向治疗蓬勃发展，但由于癌症发生过程的复杂性，单独治疗模式往往效果不好，以分子机制为基础的联合作用有望取得更好的疗效。 环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一种诱生性酶，受到各种细胞因子、生长因子及肿瘤活化因子等刺激后表达水平迅速升高，其主要功能是把花生四烯酸转变成前列腺素。COX-2在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用，涉及细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移、血管生成以及细胞免疫机制等方面。研究发现多种恶性肿瘤包括肝癌、鼻咽癌、肺癌、大肠癌、前列腺癌及乳腺癌等都存在COX-2的高表达。因此COX-2可能成为恶性肿瘤治疗的新靶点。 体外研究证实COX-2特异性抑制剂能促进肿瘤细胞的凋亡，进一步研究发现在体条件下COX-2特异性抑制剂能抑制多种肿瘤的形成和／或转移。但COX-2抑制剂单独作用对肿瘤的抑制效应有限，用量过大增加其副作用，与其他疗法联合应用有可能提高其抗肿瘤效应。 光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)是一种新型的肿瘤治疗方法。它利用光敏剂分子接受特定波长的光能后通过光化学反应和能量传递过程将光能转化为分子内能，在有氧条件下，产生多种活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)，包括单线态氧(1O2)、氧自由基、羟自由基等，从而破坏蛋白质、核酸和脂类等生物大分子，导致细胞凋亡或坏死。PDT独特的优势是毒副作用非常小，能治疗多种肿瘤且不易产牛耐药性。研究显示PDT治疗肿瘤的过程中诱导了COX-2的表达，故给予COX-2抑制剂有可能提高PDT的治疗效果。因此COX-2抑制剂联合PDT成为目前研究的热点。以往体内外研究已经部分证实COX-2特异性抑制剂可以显著提高PDT的治疗效果，这些研究所用到的光敏剂为Photofrin、5-ALA或Hypericin；所用到的光源为荧光灯、染料激光器或卤素灯。而以血卟啉单甲醚(HMME)为光敏剂，发光二极管(LED)为光源的PDT联合塞来昔布对CNE-2和HepG2细胞的研究还未见报道。 本课题拟采用CNE-2和HepG2细胞研究塞来昔布(celecoxib)联合血卟啉单甲醚(HMME)介导的PDT对肿瘤细胞增殖的影响，MTT法取得塞来昔布的剂量、光敏剂的浓度及激光能量密度实验参数的优化结果，同时通过Annexin V／PI双染法定量检测凋亡率，流式技术观察线粒体膜电位的变化，Caspase-3试剂盒测定药物作用前后caspase-3活性的变化，并采用免疫组化法检测药物处理后COX-2的表达变化情况，初步探讨可能的作用机制。 方法： 实验分为空白对照组、单独塞来昔布组(CNE-2：64～125μ M；HepG2：40.96～80μM)、单独PDI、组(2.5 μg／ml HMME，0～0.5J／cm。)及塞来昔布联合PDT组。将CNE-2和HepG2细胞分别分组处理后，MTT法检测各组作用24h后的抑制率。采用金氏公式评估联合作用对肿瘤细胞的杀伤足否具有协同效应，每种细胞各选出一组具有协同效应的联合模式用于以下试验的研究。 经MTT法选出CNE-2细胞的联合模式为：control、CX(80 μ M)、PDT(2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2)及CX+PDT；HepG2细胞的联合模式为：control、CX(64μM)、PDT(2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2)及CX+PDT。CNE-2和HepG2细胞经以上联合模式处理后观察以下指标：HE染色光镜观察、Hoechst 33342染色荧光显微镜观察各组处理24h后细胞及细胞核的形态学变化；Annexin V／PI双染流式细胞仪检测各组处理24h后的细胞凋亡率；Rhodamine 123染色流式细胞仪检测各组处理6h后线粒体膜电位的变化情况；Caspase-3活性检测试剂盒检测各组处理16h后caspase-3酶活性的变化，并采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，caspase-3酶活性的结果用蛋白浓度标准化；免疫细胞化学法检测各组处理24h后COX-2的表达情况。应用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，各数据以均数±标准差表示，P<0.05表示有统计学意义。 结果： 1.塞来昔布对CNE-2、HepG2细胞的抑制率呈剂量依赖性。64 μ M和80 μ M的塞来昔布对CNE-2细胞的抑制率分别是4.84％和13.23％，这两个浓度的塞来昔布对HepG2细胞的抑制率分别是17.17％和34.48％。可见HepG2细胞对塞来昔布更敏感。 光敏剂浓度为2.5μg/ml、光照射剂量分别为O．125 J／cm2、0.25 J／cm2和0.5J／cm2时，CNE-2和HepG2细胞的抑制率分别为13.76％、28.34％、39.5％和15.57％、25.14％、39.72％，说明HMME-PDT对两种细胞的杀伤作用呈剂量依赖性，由数据可看出PDT对两种细胞的增殖影响差别不大。 塞来昔布和PDT联合处理两种肿瘤细胞，金氏公式分析联合效应的结果显示：(1)对于CNE-2细胞，64 μ M和80μ M的塞来昔布与光敏剂浓度为2.5μg/ml、光照射剂量分别为0.125 J／cm2、0.25 J／cm2和0.5J／cm2的PDT组联合产生协同效应。其中80 μ M的CX组，2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2的PDT组以及两者的联合处理组的抑制率分别为13.23％、28.34％和44.57％，联合处理组与单独处理组相比，抑制率有显著差异(P<0.05)；(2)对于HepG2细胞，40.96 μ M、51.2 μ M和64μM的塞来昔布与光敏剂浓度为2.5μg／ml、光照射剂量为0.25J／cm2的PDT组联合产生协同效应。其中64 μM的CX组，2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2的PDT组以及两者的联合组的抑制率分别为17.17％、25.14％和44.87％，联合处理组与单独处理组相比，抑制率有显著差异(p<0.05)。 2.HE染色光镜观察和Hoechst染色荧光显微镜观察结果显示80 μM或64 μM CX组、PDT组和CX+PDT组作用24h后CNE-2或HepG2细胞均发生明显的形态变化，细胞呈凋亡或坏死样改变，联合处理组比单独处理组更明显。 3.流式细胞仪检测凋亡率，结果显示80 μM的CX联合2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2 PDT组可诱导CNE-2细胞发生凋亡和坏死，细胞凋亡率可达55.6％；64μM的CX联合2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2 PDT组诱导HepG2细胞的凋亡率达50.8％。 4.免疫细胞学染色结果显示对照组细胞CNE-2和HepG2均表达COX-2，HMME-PDT处理后未发现CNE-2和HepG2细胞COX-2表达的增强。塞来昔布组和联合处理组COX-2的表达显著下调。 5.流式细胞仪检测线粒体膜电位，对于CNE-2细胞，80 μM CX、PDT及CX+PDT处理组作用6h后单独CX和PDT组膜电位均明显下降，联合组比单独处理组下降更明显。而HepG2细胞，64 μM的CX组作用6h后膜电位显著下降，6h后PDT组轻微下降，联合组比单独CX组下降更明显。 6.80μM或64μM CX、PDT及CX+PDT处理CNE-2或HepG2细胞后，caspase-3的表达不同程度的上调，以联合用药组最明显。 结论： 1.塞来昔布和HMME-PDI单独作用对CNE-2、HepG2细胞有明显的增殖抑制作用，这种抑制作用呈剂量依赖性。塞来昔布联合HMME-PDT在一定的剂量范围内可以协同杀伤CNE-2或HepG2细胞。 2.塞来昔布联合HMME-PDT可诱导CNE-2、HepG2细胞发生凋亡。 3.诱导凋亡的机制可能是通过使线粒体膜电位下降，激活caspase-3凋亡通路实现的。