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目的:肝纤维化是各种慢性肝病的共有病理基础,目前认为肝纤维化发生的主要机制是肝脏细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡,导致ECM在肝内过度沉积。肝星状细胞(HSC)是位于Disse间隙的一种间质细胞,正常情况下处于静息状态,活化后HSC表达α-SMA水平增高,合成包括胶原在内的ECM,故而HSC的激活和增殖已成为肝纤维化发生的中心环节。结缔组织生长因子(CTGF)是一种细胞生长调节因子,与细胞增殖、分化的调控及组织器官纤维化的发生密切相关,其在肝纤维化发生、发展中扮演着重要角色。临床上抑制甚或逆转肝纤维化向前发展极为重要,但目前尚缺乏可靠有效的药物。姜黄素(curcumin)是从姜黄属中药分离出的主要药理活性成分,具有抗炎、抗脂质过氧化、抗肿瘤、保肝等多种药理作用。大量研究证实,姜黄素可通过多种途径发挥抗肝纤维化作用。本实验通过检测CCL4诱导的小鼠肝纤维化肝组织中CTGF的表达,以及姜黄素对肝细胞株HSC-T6增殖的影响,探讨CTGF在肝纤维化发展中的作用,探讨姜黄素防治肝纤维化的可能机制,并为肝纤维化的治疗提供新的靶点。方法:6～8周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分为4组,正常对照组、模型对照组、姜黄素预防组和姜黄素治疗组。除正常对照组外,各组小鼠均给予四氯化碳5ul/g体重(与橄榄油以1:9混合)腹腔注射,每周2次,共8周。姜黄素预防组、姜黄素治疗组小鼠分别于试验第一周和第七周给予姜黄素50 mg/kg体重,每周3次灌胃处理,正常对照组给予等剂量蒸馏水灌胃,每周3次。所有小鼠均于8周后处死。小鼠断头取血检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),透明质酸(HA)水平;肝组织行苏木精-伊红(HE)染色和Masson胶原染色,观察肝脏病理组织学炎症和纤维化改变;免疫组织化学方法检测CTGF、α-平滑肌收缩蛋白(α-SMA)的含量,采用北京航空航天大学真色彩病理图像分析系统分析结果,每个样本取3张切片,每张切片取5个视野进行图像分析,分析各图象阳性面密度(阳性细胞所占面积/视野总面积×100%);逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR )法检测肝组织CTGF mRNA的表达;流式细胞技术检测姜黄素对体外培养的大鼠肝星状细胞(HSC-T6)细胞周期和的凋亡率的影响。结果:1小鼠一般情况:正常组小鼠精神状态良好,活动自如,毛发整齐有光泽,食欲好,每周体重增长正常。模型组小鼠随着四氯化碳注射时间的延长,变得易激惹,个别具有攻击性,毛发失去光泽,紊乱,精神萎靡,食欲下降,体重增长慢或不增。而姜黄素治疗组随着给药天数的增加,造模时的症状逐渐得到改善。8周末,与正常对照组相比,模型对照组、姜黄素预防组和姜黄素治疗组小鼠体重明显下降,差异有统计学意义(P值均<0.05)。与模型对照组比较,姜黄素预防组和治疗组小鼠体重有所增加,差异有统计学意义(P值均<0.05)。姜黄素预防组和姜黄素治疗组小鼠体重相比,差异无统计学意义(P>0.05)。2血清学指标:实验动物血清ALT水平,模型对照组(168.62±13.75 U/L)>姜黄素治疗组(104.86±11.68 U/L)>姜黄素预防组(82.98±9.57U/L)>正常对照组(47.91±8.08 U/L),各组之间ALT水平的两两比较均有统计学意义,P <0.05 ;实验动物血清H A水平,模型对照组( 1609.95±125.91ng/ml ) >姜黄素治疗组(1290.26±127.59ng/ml)>姜黄素预防组(953.39±98.48ng/ml)>正常对照组(759.10±77.31ng/ml),各组之间HA水平的两两比较均有统计学意义,P<0.05。3肝组织病理学检测3.1肝组织标本形态:正常对照组小鼠肝脏为红褐色,明亮有光泽;模型对照组小鼠肝脏大体色泽偏暗,表面欠光滑,体积较正常对照组略有减小,肝脏边缘变钝,质地较实,肝脏表面可见散在黄色脂肪颗粒;姜黄素预防组和姜黄素治疗组小鼠肝脏红褐色,有光泽,体积未见明显缩小。3.2肝组织病理HE染色正常对照组小鼠肝组织结构清晰,肝细胞大小均匀,无变性、坏死,肝小叶结构存在,小叶内肝细胞索排列较整齐;模型对照组可见肝小叶结构被破坏,肝索排列紊乱,有炎症细胞浸润,肝细胞水肿,部分可见假小叶形成;姜黄素预防组可见汇管区有少量的纤维组织增生,未见假小叶形成,可见少量炎症细胞浸润,肝细胞水肿明显减轻;姜黄素治疗组小鼠肝组织情况介于模型对照组组和姜黄素预防组之间。3.3肝组织病理Masson染色显微镜下重点观察蓝色胶原纤维分布情况,正常对照组仅于血管周围可见少量蓝色纤维,细且短,肝小叶结构正常,期间未见纤维增生;模型对照组肝脏组织中纤维明显增多,分布广泛,可相互连接形成较粗大的纤维间隔,多位于汇管区和血管周围;姜黄素预防组可见较细的蓝色纤维走行于血管周围,数量较正常组稍多;姜黄素治疗组纤维数量较姜黄素预防组增多,但较模型对照组少,部分纤维粗大,亦多走行于血管周围。4免疫组织化学染色4.1α-SMA免疫组织化学染色:与空白阴性对照比较,以细胞和组织棕黄色染色为阳性表达。正常对照组无α-SMA阳性染色,其余实验组组中α-SMA主要表达于汇管区血管壁中、肝纤维组织与肝实质交界处,少量表达于肝实质的窦周间隙,偶见于中央静脉壁中。四组α-SMA表达量:模型对照组(8.21±1.48)>姜黄素治疗组(6.25±1.69)>姜黄素预防组(4.78±1.32)>正常对照组(1.51±0.95),两两比较,P <0.05,差异具有统计学意义。4.2 CTGF免疫组织化学染色:与空白阴性对照比较,以细胞和组织染为黄色或棕黄色视为阳性表达。正常对照组CTGF基本无表达(0.31±0.19)%,模型对照组CTGF表达量最高(5.49±0.29)%,分布在汇管区、门静脉及纤维间隔、肝星状细胞等位置。姜黄素预防组(0.95±0.21)%较姜黄素治疗组(1.82±0.32)%阳性表达少,两者比较,P <0.05,差异具有统计学意义。5肝组织CTGFmRNA表达:与正常对照组(0.15±0.02)相比,模型对照组(0.42±0.02)、姜黄素预防组(0.27±0.01)、姜黄素治疗组(0.34±0.01)CTGFmRNA表达明显增加,而姜黄素预防组及治疗组表达较模型对照组明显下降,且表达量:姜黄素预防组<姜黄素治疗组,两者比较,P <0.05,差异具有统计学意义。6流式细胞技术检测姜黄素对体外培养的大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞周期和凋亡率的影响6.1姜黄素对HSC细胞形态学影响姜黄素40μmol/ L作用于体外培养的大鼠HSC,24 h后,倒置相差显微镜观察细胞形态学改变,结果显示:姜黄素处理后,HSC细胞发生皱缩,出现凋亡现象,凋亡细胞体积较正常细胞变小,核染色质浓缩,沿核膜排列,细胞器也发生浓缩,并可见凋亡小体。6.2姜黄素对HSC细胞周期和细胞凋亡的影响6.2.1分别以10μmol/ L、20μmol/ L、30μmol/ L、40μmol/ L、50μmol/ L的姜黄素浓度作用于HSC-T6细胞24h,用流式细胞仪(Beckman)测定细胞周期和细胞凋亡情况,并应用Single histogram ststistic分析软件测定细胞周期变化和细胞凋亡率。结果显示:姜黄素浓度在10、20、30、40、50μmol/L时出现明显的亚二倍体凋亡峰,各组的凋亡指数( %)分别是6.8±0.6、11.8±1.5、21.3±2.1、29.4±3.7、48.6±4.3,与对照组(1.9±0.6)相比,差异具有统计学意义( P < 0. 01)。6.2.2在10～50μmol/ L浓度范围内,随着姜黄素浓度的增加,G0/G1期细胞比例略有增多,而S期细胞比例逐渐下降,G2/M期比例明显增加。表明姜黄素可使HSC发生G2/M期停滞,进而诱导细胞凋亡。结论:1应用10%CC14橄榄油溶液腹腔注射8周,可成功建立符合血清生化学和病理特征的小鼠肝纤维化模型。2结缔组织生长因子与肝纤维化的发生密切相关,作为一种促肝纤维化因子,其过度表达主要促进HSC的增殖活化,促进细胞外基质的形成,从而参与肝纤维化的发生、发展。3姜黄素可以预防四氯化碳所致的小鼠肝纤维化,并对已经形成的四氯化碳所致的小鼠肝纤维化有一定的治疗作用。其机制可能与抑制CTGF的表达,抑制HSC的增殖活化,促进HSC凋亡有关。