【摘 要】
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目的:骨性关节炎（OA）是影响关节活动、造成关节疼痛的最常见慢性退行性疾病,多见于髋关节和膝关节的病变。然而,目前对OA确切的发病机制仍不清楚,但已知软骨细胞凋亡是OA发生发展的重要原因之一。针对干预介导软骨细胞凋亡的病理因素有助于减轻软骨退变和关节疼痛。吲哚胺2,3双加氧酶1（IDO1）在OA患者关节液中高表达,并可作为软骨退变的病理标志物。但是IDO1在软骨细胞中高表达能否促进软骨细胞凋亡及其
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目的:骨性关节炎（OA）是影响关节活动、造成关节疼痛的最常见慢性退行性疾病,多见于髋关节和膝关节的病变。然而,目前对OA确切的发病机制仍不清楚,但已知软骨细胞凋亡是OA发生发展的重要原因之一。针对干预介导软骨细胞凋亡的病理因素有助于减轻软骨退变和关节疼痛。吲哚胺2,3双加氧酶1（IDO1）在OA患者关节液中高表达,并可作为软骨退变的病理标志物。但是IDO1在软骨细胞中高表达能否促进软骨细胞凋亡及其分子机制仍不清楚。因此,本研究旨在探究IDO1在软骨细胞凋亡的作用及分子机制。方法:（1）本研究从股骨颈骨折后需行关节置换患者的关节软骨中分离人正常软骨细胞,传至P2代后对软骨细胞进行鉴定。（2）将软骨细胞与不同浓度的IDO1（0ng/ml、10ng/m L、50ng/m L、100ng/m L）共培养后行CCK8实验,检测细胞凋亡情况,并在50ng/m L IDO1共培养72h检测细胞凋亡活性,建立软骨细胞凋亡微环境模型。（3）收集Ctrl组和IDO1组软骨细胞总RNA并通过高通量测序技术筛选m RNA的差异变化,采用RT-q PCR和免疫荧光法探究IDO1通过m RNA调控软骨细胞凋亡的分子机制。（4）通过高通量测序技术筛选Ctrl组和IDO1组软骨细胞中miRNA的差异表达,采用Target Scan分析和RT-q PCR实验探究IDO1通过miRNA调控FN1表达的分子机制。结果:（1）通过软骨细胞II型胶原和蛋白多糖的表达,分离并鉴定了原代软骨细胞。（2）探究IDO1在软骨细胞凋亡中的作用,将IDO1与软骨细胞共培养后发现该软骨细胞呈凋亡状态,其中50ng/m L IDO1作用72h后软骨细胞凋亡明显增加。（3）探究IDO1促进软骨细胞凋亡的机制,将IDO1作用下的软骨细胞提取RNA后进行m RNA高通量测序,发现m RNA-Fibronectin1（FN1）的表达显著下调。（4）通过RT-q PCR和免疫荧光法实验发现IDO1作用下的软骨细胞FN1和COLA2表达减少,caspase3的表达增加,表明IDO1通过下调FN1的表达促进软骨细胞凋亡。（5）探究IDO1通过miRNA调控FN1的表达,在IDO1作用下的软骨细胞提取RNA后进行miRNA高通量测序,发现在IDO1作用下的软骨细胞miRNA-146a-5p表达显著上调。（6）在Target Scan生物信息分析提示FN1是miRNA-146a-5p理想下游靶点,并且通过RT-q PCR实验发现miRNA-146a-5p的表达上调,进而抑制FN1的表达。结论:（1）随着IDO1与软骨细胞共培养下的浓度、时间的增加,细胞凋亡比例也会增加,其中在50ng/ml下的IDO1与软骨细胞共培养72h的凋亡明显增加。（2）在软骨细胞中,IDO1通过下调FN1,促进软骨细胞凋亡。（3）在软骨细胞中,IDO1通过上调miRNA-146a-5p,进而抑制FN1的表达。因此初步得出IDO1在软骨细胞凋亡的分子机制为IDO1通过上调miRNA-146a-5p,抑制FN1的表达,促进软骨细胞凋亡。
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