毕赤酵母表达系统作为目前应用最为广泛的表达系统，具有高等真核表达系统的许多优点，如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等;具有醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高;外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在;此外，它比哺乳动物、植物、昆虫等其他真核表达系统操作上更简单、快捷、成本低且表达水平更高。本实验利用毕赤酵母表达系统对神秘果素、纳豆激酶及多酚氧化酶进行表达，结果如下:　　 (1)成功构建了神秘果素、纳豆激酶及多酚氧化酶基因的酵母胞内表达载体pPICZA-SMIR、pPICZA-NK、 pPICZA-PPO和分泌表达载体pPICZαA-SMIR、pPICZαA-NK、pPICZαA-PPO。　　 (2)获得了3个酵母胞内表达重组子pPICZA-SMIR-X33、pPICZA-NK-X33、pPICZA-PPO-X33和3个分泌表达重组子 pPICZαA-SMIR-X33、pPICZαA-NK-X33、pPICZαA-PPO-X33。　　 (3)用1％的甲醇对神秘果素胞内表达pPICZA-SMIR-X33及分泌表达的酵母重组子pPICZαA-SMIR-X33进行诱导，对表达产物进行SDS-PAGE电泳，没有发现有特异性的蛋白条带，且经活性测定也未检测到改变味觉的活性。　　 (4)用1％的甲醇对纳豆激酶胞内表达的酵母重组子pPICZA-NK-X33进行诱导，也未检测到活性。而分泌表达重组子pPICZαA-NK-X33中有2个菌株分泌纳豆激酶活性较大，对其中一个菌株用1％-10％的甲醇进行诱导，发现0.5％-5％的甲醇诱导时纳豆激酶的活性与甲醇浓度呈正相关，5％的甲醇诱导时纳豆激酶的活性最大，用四肽底物法测得酶活为3.6IU，而10％的甲醇诱导时活性明显下降。同时对分泌表达重组子pPICZαA-NK-X33胞内的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析及活性测定，发现细胞内存在带信号肽的纳豆激酶，分子量大小50KD左右，其含量约占胞内总蛋白的10％。　　 (5)先用1％的甲醇诱导对多酚氧化酶胞内表达重组子pPICZA-PPO-X33和分泌表达重组子pPICZαA-PPO-X33进行诱导，胞内表达酵母重组子未检测到活性;分泌表达重组子pPICZαA-PPO-X33有活性。用不同浓度的甲醇(1％-10％)诱导，发现各浓度甲醇诱导多酚氧化酶活性无显著差异。　　 本研究构建了神秘果素、纳豆激酶和多酚氧化酶的真核表达系统，对它们在毕赤酵母中的表达量及活性进行分析，初步探索甲醇浓度对蛋白表达的影响。其中神秘果素表达产物未检测到活性;不同浓度甲醇诱导时，多酚氧化酶的表达及活性没有显著差异;纳豆激酶最佳甲醇诱导浓度为5％。本研究为外源基因在毕赤酵母中的表达提供更有力的依据。