诱导玉米大斑病菌附着胞发育基底材料筛选及附着胞标志基因鉴定

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玉米大斑病(Northern corn leaf blight,NCLB)是由大斑病凸脐蠕孢(Setosphaeria turcica)引起的真菌性病害,是玉米生产中重要病害之一。当前玉米大斑病防控仍以杀菌剂为主。然而,大多数杀菌剂特异性弱,对各种非目标生物具有毒性;且病原真菌易对杀菌剂产生耐药性。构建绿色杀菌剂的高通量筛选系统是玉米大斑病有效防控的基础。附着胞是玉米大斑病菌侵染寄主的特化结构,也是杀菌剂的理想靶标。玉米大斑病菌附着胞的形成与植物表面物理性质密切相关。筛选有效阻断附着胞发育的杀菌剂需要在玉米叶片上施药处理分生孢子后进行显微观察,操作费时费力且无法实现高通量筛选。本研究一方面筛选获得能诱导附着胞发育的涂层材料,在此涂层上进行附着胞诱导和药物筛选;另一方面鉴定获得能表征附着胞发育的标志基因,通过基因表达分析表征附着胞形成,从而替代显微观察。这两方面整合为实现靶向附着胞发育的杀菌剂高通量筛选奠定基础。一方面,本研究筛选水性树脂涂层材料,得到了一种可诱导玉米大斑病菌附着胞形成,且诱导效果稳定的涂层,即半硅型水性聚氨酯树脂(Si-PUD)和聚四氟乙烯(PTFE)树脂体积比1:1的混合涂层;另一种仅诱导玉米大斑病菌形成芽管的涂层,即Si-PUD涂层。这两类涂层具有光学透明性、耐溶剂性和热稳定性等性质,利于显微观察及高通量体系构建;且涂层制备简单,涂料涂布基质,干燥后即可形成涂膜。此外,这两类涂层对玉米小斑病菌有类似诱导效果,证明涂层对病原真菌附着胞发育具有一定的普遍适用性。另一方面,本研究通过蛋白组分析技术鉴定获得了 366个在附着胞时期差异性表达基因,根据基因功能注释和蛋白互作紧密程度,筛选了 40个差异性表达基因进行q-PCR验证。利用已知抑制附着胞的药物羟基脲(HU),喜树碱(CPT)以及甲基磺酸甲酯(MMS)对q-PCR验证获得的标志基因进行优化确定。此外,在玉米小斑病菌中对用药物筛选出的标志基因进行进一步验证,确定标志基因的适用性,最终获得5个表征玉米大斑病菌附着胞的标志基因,分别编码糖苷水解酶家族蛋白GH16(Glycosyl hydrolases family 16),几丁质生物合酶 CHS5(chitin biosynthesis protein),肌动蛋白细胞骨架调控复合物蛋白SLA 1(actin cytoskeleton-regulatory complex protein)以及2个编码含Zn(2)-Cys(6)双核簇结构域的转录因子的基因。本研究对诱导玉米大斑病菌附着胞涂层及其标志基因的确立,可突破利用寄主施药配合显微观察评价的局限,用于构建高通量筛选系统,为快速筛选抑制玉米大斑病菌附着胞的绿色杀菌剂奠定基础。此外,本研究获得多个标志基因,能更准确的表征附着胞,并且本研究研发的诱导玉米大斑病菌附着胞的涂层及确定的附着胞标志基因,对玉米小斑病菌有相同诱导和表征作用,表明其对其它产生附着胞的病原真菌具有适用性。
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