【摘 要】
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目的:TIGD1是Tigger家族转座子衍生蛋白之一,据报道,TIGD1功能未知,但预测与细胞周期相关。有生物信息学分析发现TIGD1在肾上腺皮质癌中高表达并被证明与预后相关,此外TIGD1作为转录因子对结肠癌患者的总生存期具有预测性能。然而,TIGD1在非小细胞肺癌中的具体作用尚无报道。因此,在人非小细胞肺癌组织和体外细胞系中TIGD1的表达情况及其发挥作用的分子机制为本研究的主要内容。研究方法
【基金项目】
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辽宁省高等学校创新团队（No.LT2015029）；
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目的:TIGD1是Tigger家族转座子衍生蛋白之一,据报道,TIGD1功能未知,但预测与细胞周期相关。有生物信息学分析发现TIGD1在肾上腺皮质癌中高表达并被证明与预后相关,此外TIGD1作为转录因子对结肠癌患者的总生存期具有预测性能。然而,TIGD1在非小细胞肺癌中的具体作用尚无报道。因此,在人非小细胞肺癌组织和体外细胞系中TIGD1的表达情况及其发挥作用的分子机制为本研究的主要内容。研究方法:1、本研究应用UALCAN数据库分析了TIGD1在肺鳞癌、肺腺癌中与正常肺组织中的表达差异。采用Kaplan-Meier数据库分析在肺癌患者中TIGD1的表达与总生存期的联系。应用基因富集分析（GSEA）对TIGD1的基因功能进行预测。2、选取99例非小细胞肺癌组织进行免疫组化实验检测TIGD1的表达及定位情况并且进行统计学分析以探究TIGD1的表达量与临床病理因素的联系。3、细胞经过转染质粒、siRNA等处理后对细胞的生物学功能进行检测,其增殖情况采用MTT实验和克隆形成实验,迁移情况采用Transwell实验。4、对经过处理的细胞应用Western Blot检测细胞增殖、抗凋亡、迁移相关蛋白以及JAK2、磷酸化JAK2、STAT3、磷酸化STAT3等相关通路蛋白的表达。5、在敲减了TIGD1的细胞中应用qPCR对TIGD1以及JAK2的RNA水平进行检测。结果:1、UALCAN数据库分析发现TIGD1在肺鳞癌、肺腺癌中的mRNA水平较高,而在正常肺组织中的mRNA水平较低,并且该差异有统计学意义。免疫组化数据显示,TIGD1主要存在于细胞核中,在细胞质中含量较少。统计分析表明TIGD1的表达与肿瘤体积、淋巴结转移、TNM分期正相关。Kaplan-Meier分析表示,高表达TIGD1的肺癌患者具有较短的总生存期。说明TIGD1的高表达预示着不良预后。2、GSEA结果表明TIGD1与细胞周期相关。进行了MTT、克隆形成实验后我们发现,在A549及H460细胞中提高TIGD1的表达量后,细胞的增殖能力以及克隆形成能力增强,而在SK-MES-1及H460细胞中敲低TIGD1后则相反。随后应用Western Blot检测发现当TIGD1的表达量发生变化时,细胞周期相关蛋白CDK6、Cyclin D1及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表达量随之改变。3、进行Transwell实验测定细胞迁移状态的变化,发现在A549及H460中提高TIGD1的表达量后增强了细胞迁移能力,而在SK-MES-1及H460中敲减TIGD1后得到相反结果。Western Blot检测蛋白表达量发现TIGD1能够调节细胞迁移相关蛋白RhoA、RhoC的表达。4、在选定细胞系中使用Western Blot来检测经典信号通路中的关键分子及其磷酸化形式发现,其中JAK2、磷酸化JAK2、磷酸化STAT3、磷酸化AKT、磷酸化ERK的表达随TIGD1的变化而改变。随后利用qPCR实验对JAK2进行RNA水平检测,发现在敲低TIGD1后,JAK2的RNA水平随之发生改变。5、在A549、H460中同时进行TIGD1的过表达及JAK2的敲减,通过MTT、克隆形成、Transwell及Western Blot实验检测后发现TIGD1过表达所导致的促癌作用可以被JAK2的抑制逆转,说明TIGD1对非小细胞肺癌生物学功能的调节作用是通过JAK2/STAT3信号通路来完成的。结论:1、TIGD1在非小细胞肺癌组织中高表达,与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期等临床病理因素成正相关,并提示预后不良。2、TIGD1通过正向调控JAK2/STAT3信号通路促进非小细胞肺癌的增殖及迁移。
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