食管癌是世界范围内最常见的消化系统恶性肿瘤之一。其发病率和死亡率分别居于第六位和第四位。食管癌早期隐匿,大多数患者发现时已经有吞咽梗阻症状,或者出现远处转移及淋巴结转移。美国国家癌症研究所监测、流行病学及预后（Surveillance,Epidemiology and End Results,SEER）数据库统计,诊断时处于局限期的食管癌仅占25%,食管癌患者的5年生存率低于20%。由此可见,食管癌不仅发病率高而且预后极差。食管癌不良预后事件是导致食管癌患者生存期缩短的重要原因。临床上食管癌远处转移的发生率在25%左右,但尸检发现近50%的食管癌患者有远处转移。有远处转移的患者,中位生存期只有3-10个月,与局限期食管癌患者相比,这些患者病情常常发展更快,肿瘤的侵袭性更高。恶性食管瘘是中晚期食管癌最严重的并发症,发生率为5.6%-33%,食管瘘一旦发生预后极差,患者往往因营养衰竭、肺部感染、纵隔脓肿和大血管损伤而在短期内死亡,中位生存期仅有3个月。区分高危患者并及早进行干预,避免不良事件发生是提高食管癌治疗效果的重要手段。但遗憾的是,目前对于食管癌的远处转移与食管瘘的早期预测均缺乏研究,主要原因是单纯临床病理因素预测准确率低,又缺乏可靠的生物标记物。肿瘤的影像表现是微观基因、蛋白质和分子改变的宏观体现,可以反映肿瘤的生物学特点。但传统的影像医学在肿瘤的评估中只能提供定性的特征信息,如大小、形态、强化方式等,具有很强的主观性且不易重复,难以达到精准化医疗的要求。随着人工智能（Artificial intelligence,AI）和机器学习技术（Machine learning,ML）的发展,2012年Lambin提出了影像组学“Radiomics”的概念,其核心思想是从多模态的医学图像中提取高维数据信息,用于精准医学决策。AI和ML是影像组学研究的重要工具,因为影像组学研究的对象是高维图像特征,由数学算法从图像中提取,如描述肿瘤形态的形状特征（Shape-based features）、直方图分布的一阶统计量（First-orderclass）,还有纹理特征（Texture-based features）等,每种分类包含多种数据提取算法,同时又可以通过不同的算法生成新的特征。对于这种高维数据,传统的统计方法是难以处理的,而AI和ML可以有效的从高维数据中选择相关性好且可靠的特征,剔除冗余特征,实现影像特征与临床结局的有效结合。除了特征选择,AI和ML还可以将临床、影像、基因、病理等多维数据进行整合,以算法模型或分类器方式用于临床实践,实现对临床事件的精准预测。人工智能是通过不同机器学习算法实现的,本研究使用了最小绝对值收缩与选择算子（Least absolute shrinkage and selection operator regression,Lasso）、支持向量机（Support vectormachine,SVM）、弹性网络（Elastic net,EN）、K 最近邻（K nearest neighbor,KNN）、随机森林（Random forest,RF）、逻辑回归（Logistic regression,LR）、线性回归（Liner regression）、交叉验证（Cross validation,CV）、自举法（Bootstrap）等多种机器学习方法,实现了高维影像特征的精准筛选,临床病理特征、影像组学、生物学特征的有效整合,以有监督学习的方式构建精准可靠的预测模型,实现食管癌预后不良事件的精准预测。本研究还充分利用了公共数据库资源,使用机器学习方法挖掘食管癌远处转移相关的浸润免疫细胞和基因的数据,然后通过临床病理标本和体外实验进行验证,从免疫微环境和驱动基因两个层面对食管癌远处转移的机制进行了探索。本文以食管癌预后不良事件为关注点,研究了食管癌远处转移和食管瘘的预测、转移性食管癌免疫微环境的特点和远处转移相关基因CCT2,章节间相对独立又互相关联,组织结构图如下:第一章 基于机器学习的多维数据分析在食管癌远处转移中的研究第一节 数据库的大数据分析预测食管癌远处转移的研究目的:1.使用数据库大数据开发便于临床使用的可视化列线图（Nomogram）模型,个体化预测食管癌远处转移风险,并以中国患者数据作为外部验证集,鉴定模型的泛化能力和实用价值。2.通过对大数据的分析,筛选出食管癌远处转移独立风险因素,作为后续研究中临床预测因素的参考和依据。方法:训练集为SEER数据库2010年至2015年确诊的食管癌患者。单因素Logistic回归分析对各临床病理因素逐一进行评估。将有统计意义的预测因素（变量）纳入Logistic多因素分析。以独立预测因素为参数建立Nomogram预测模型。内部验证是采用C指数（Concordance index,C-index）和受试者工作曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）及曲线下面积（Area under the curve,AUC）来评价模型区分度。使用自举法（Bootstrap,1000次迭代）来计算校正C指数。校正曲线（1000次迭代）验证预测模型的校准度。决策曲线（Decision curve analysis,DCA）评价预测模型的临床实用性,并将其与T分期,N分期,病理分级等传统的预测指标进行对比。收集在山东省肿瘤医院初次就诊的141例食管癌患者的数据作为外部验证集,评价模型的泛化能力和在中国人群中的应用价值。结果:训练集共纳入9026例患者进行分析。预测模型参数包括:年龄、性别、种族、分化程度、T分期、N分期、组织学、肿瘤部位。C指数为0.747（95%CI:0.734-0.760）,自举法校正C指数为0.745,AUC为0.738,具有良好的区分度。校正曲线显示列线图预测与实际吻合良好。决策曲线显示良好的临床实用性。与传统的预测方法相比,列线图预测模型具有更好的净效益。收集141例中国食管癌患者的病例资料作为外部验证集,AUC为0.780（95%CI:0.706-0.855）,C指数0.743。提示模型具有良好的泛化能力和实用价值。结论:1.构建并验证了可视化食管癌远处转移预测模型,便于临床医生预测食管癌患者远处转移风险。2.年龄、性别、种族、T分期、N分期、组织学、肿瘤部位、病理分级均为食管癌远处的独立风险因素,可以作为后续研究筛选变量的依据。第二节 基于机器学习的多维整合模型预测食管癌远处转移的研究目的:1.食管癌原发病灶的CT影像组学特征中筛选与食管癌远处转移相关性最好的特征,使用不同机器学习方法构建模型,以探讨其作为生物标记预测远处转移的可行性。2.开发基于影像组学标记物和临床特征的可视化Nomogram预测模型,个体化预测食管癌远处转移风险。方法:共纳入299例初次就诊的食管癌患者,按7:3比例随机分为训练集（n=197）和验证集（n=102）。Logistic回归筛选出临床独立预测因素并构建临床预测模型作为比较模型效能的对照。从食管癌治疗前的增强CT中提取影像组学特征,Lasso-Logistic回归算法从中筛选出最具相关性且无冗余的特征集。四种机器学习方法:支持向量机（SVM）,K最近邻（KNN）,随机森林（RF）,逻辑回归（LR）分别对筛选出的影像组学特征建立食管癌远处转移的影像组学预测模型,评价预测效能。筛选出的特征集构建标签,与临床独立预测因素拟合构建多维预测模型。在验证集中对各模型的区分度（ROC/AUC）、校准度（校准度曲线）、拟合优度（赤池信息准则）、重分类能力（净重分类改善度和综合判别改善度）、临床获益（DCA曲线）进行验证,并比较模型的预测效能。结果:以年龄、淋巴结（N）分期、组织分化程度构建的临床预测模型,验证集AUC=0.731（95%CI:0.626-0.836）,训练集 AUC=0.82（95%CI:0.773-0.886）,赤池信息准则（Akaike Information Criterion,AIC）=215.9。Lasso-logistic 回归从 85 1 个影像组学特征中筛选出16特征,主要为纹理特征和小波变换后的纹理特征（10/16）。Delong检验显示,SVM、KNN、LR构建的影像组学模型和临床模型对远处转移的区分度无显著差异（P＞0.05）,均优于RF算法构建的影像组学模型。单因素回归分析显示,Radscore在转移和未转移患者中有显著差异（P=0.000）,与临床特征构建的多维整合模型,验证集AUC=0.827（95%CI:0.742-0.912）,训练集 AUC=0.857（95%CI:0.806-0.908）,AIC=198.02,特异性 86.4%。决策曲线显示多维整合模型在各阈值概率下的净收益优于临床模型,与临床模型比较,多维模型重分类改善指数（Net Reclassification Improvement,NRI）0.114（95%CI:0.075-0.345）,综合判别改善指数（Integrated Discrimination Improvement,IDI）0.071（95%CI:0.030-0.112）,P=0.00068。在区分度、拟合优度及校准度上,多维模型也显著优于单一临床因素或影像组学构建的模型。结论:1.食管癌治疗前强化CT的影像组学特征可以作为标记物预测食管癌远处转移,影像组学预测模型预测效能与年龄、N分期和肿瘤分级构建的临床预测模型相当。2.临床病理参数和影像组学特征拟合构建的多维整合模型能够更准确的预测食管癌远处转移,实现食管癌远处转移的早期判断,可用于指导食管癌个体化治疗。第二章 转移性食管癌肿瘤免疫微环境的研究及肿瘤浸润免疫细胞对远处转移的预测价值目的:1.探索转移性食管癌肿瘤免疫细胞浸润特点,分析不同浸润免疫细胞与临床特征的关系。2.探索浸润免疫细胞标签作为生物标志物预测食管癌远处转移的价值,构建基于影像组学、免疫细胞标签、临床特征的多维整合模型,验证以机器学习方法整合的多维模型在预测临床事件中的增益作用。3.评估影像组学标签在食管癌免疫细胞浸润预测中的作用及其作为免疫治疗标记的潜在价值。方法:下载整理TCGA（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库150例食管癌患者的RNAseq数据,使用TIMER算法计算免疫细胞在食管癌中浸润的相对数量,分析转移性食管癌免疫细胞浸润特点、免疫细胞浸润对转移的预测作用。收集临床病理样本165例,免疫组化标记6种免疫细胞（CD3+T细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞,B细胞,NK细胞,巨噬细胞）,验证免疫细胞浸润与临床特征的关系。弹性网络算法（EN）构建浸润免疫细胞标签（Signature-cell）,评价其作为预测远处转移生物标记物的价值,并与影像组学标签和临床特征构建多维预测模型。分别将CD3+T细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞,NK细胞,B细胞,巨噬细胞浸润密度（根据中位计数分为高浸润和低浸润）作为预测终点,Lasso-Logistic算法筛选出最具相关性的特征,构建影像组学标签（Radscore）,在内部验证集中分别验证不同免疫细胞影像组学标签的预测效能,选择优效Radscore,在TCIA数据库（The Cancer Imaging Archive,TCIA）中进行外部验证,评价标签的鲁棒性（Robustness）以及与免疫评分的关系。结果:TCGA数据分析显示巨噬细胞在转移患者中密度显著增加（P=0.047）。生存分析显示,B细胞（P=0.043）和巨噬细胞（P=0.010）浸润较高的患者预后更差,但多因素分析未显示有显著差异。165例临床样本验证,单因素分析显示巨噬细胞、B细胞、CD3+T细胞与淋巴结转移相关;NK细胞、B细胞、CD3+T细胞与远处转移相关。多因素回归分析显示,NK细胞减少是远处转移的独立风险因素（P=0.011）,巨噬细胞浸润增加是淋巴结转移的独立风险因素（P=0.03）。弹性网络构建的免疫细胞标签可以精确预测食管癌远处转移风险AUC=0.805（95%CI:0.701-0.909）。以影像组学标签、免疫标签、临床特征构建的多维模型在训练集（AUC=0.948）和验证集（AUC=0.989）中都能有效区分远处转移患者和无远处转移患者,有良好的精确性（AUC-PR=0.775）、校准度（校准曲线）和临床决策价值（决策曲线）。相对于其他浸润免疫细胞,CD3+T细胞可以较好地被影像组学预测,9个特征构成的影像组学标签在训练集（AUC=0.813）和内部验证集中（AUC=0.765）均能有效分辨CD3+T浸润高低。CD3+T细胞浸润分布也与Radscore显著相关（P＜0.05）。在TCIA外部验证集中,Radscore预测CD3+T细胞浸润AUC=0.676,与免疫评分（XCELL算法）呈线性相关（rho=0.793,P=0.001）。结论:1.转移性食管癌肿瘤免疫微环境中的CD3+T细胞、NK细胞、巨噬细胞、B细胞浸润密度与非转移患者有显著差异,其中NK细胞浸润减少是远处转移独立风险因素,巨噬细胞浸润增多是淋巴结转移独立风险因素。2.食管癌肿瘤免疫细胞浸润标签可以作为预测远处转移的生物标记物。基于临床、影像组学和肿瘤浸润免疫细胞的多维模型预测能力显著提高。3.基于强化CT的影像组学特征可以预测CD3+T细胞浸润情况,有良好的分辨力和鲁棒性,是预测食管癌预后和免疫治疗疗效的潜在生物标记。第三章 食管癌转移相关基因CCT2的鉴定及机制研究第一节 食管癌转移相关基因CCT2的筛选和鉴定目的:1.生物信息分析筛选出食管癌远处转移有关的基因作为目的基因。2.临床样本验证CCT2基因在食管癌组织中的表达,以及与食管癌临床病理特征的关系。3.体外实验验证CCT2基因对食管癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响。方法:TCGA数据库下载食管癌mRNAseq信息及与之匹配的临床信息,远处转移样本与无远处转移样本进行差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）分析,差异基因进行蛋白互作网络（Protein protein interaction network,PPI network）分析,根据1 1种拓扑分析方法所得到的评分进行排序及文献检索确定出目的基因 CCT2。通过 TIMER 2.0 数据库基因模块（Cancer exploration）和 Oncomine 数据库不同数据集的Meta分析进行初步验证。临床样本验证:免疫组化法检测153例食管癌临床样本及17例食管粘膜上皮的CCT2表达。统计分析肿瘤组织中CCT2蛋白的表达水平与正常粘膜上皮中的表达差异;CCT2表达水平与患者临床病理特征的关系。体外实验验证:筛选CCT2高表达的食管鳞癌细胞株,小干扰RNA下调CCT2表达,Western blot验证各细胞株CCT2表达情况及敲除效率。通过EDU细胞增殖实验、细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验验证CCT2基因对食管癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果:TCGA数据库共筛选出食管癌远处转移差异表达基因55个,根据蛋白互作网络及文献检索,确定CCT2为目的基因。Oncomine数据库4个数据集Meta分析显示,CCT2在食管癌中高表达。TIMER2.0基因模块分析显示:CCT2基因在食管癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P＜0.001）;表达水平与肿瘤增殖相关基因MKI67、PCNA呈线性正相关（P=0.000）。生存分析显示,CCT2基因高表达的食管癌患者OS比低表达患者明显缩短（P=0.043）,分期校正后生存差异更加显著（P=0.007）。临床验证显示,CCT2阳性表达为胞浆呈黄色或者褐色的染色,与正常食管粘膜上皮相比,CCT2蛋白在食管癌中高表达（P=0.000）,是远处转移的独立风险因素（P=0.0363）,表达量随肿瘤分级（P=0.014）和肿瘤长度增加（P=0.013）而升高。CCT2基因在食管鳞癌细胞株普遍高表达。小干扰RNA下调KYSE150和KYSE450细胞CCT2表达后,KYSE450和KYSE150两种细胞的增殖、侵袭、迁移能力均明显降低。结论:1.CCT2在食管癌中高表达,是远处转移的独立风险因素,表达量随肿瘤分级增高和肿瘤长度增加而升高,是远处转移和恶性程度的潜在生物标记物。2.CCT2的表达促进食管鳞癌细胞增殖、侵袭、迁移。第二节 CCT2基因对肿瘤免疫微环境的影响及相关机制的初步探索目的:1.发现并验证CCT2基因对免疫微环境的影响。2.初步探索CCT2基因对免疫微环境影响的机制。方法:TIMER2.0数据库免疫模块（Immune association）分析CCT2表达与免疫细胞浸润丰度的相关性。免疫组化检测153例食管癌患者组织切片的CCT2表达水平与肿瘤浸润免疫细胞:CD8+T细胞（CD8）,CD4+T细胞（CD4）,B细胞（CD20）,巨噬细胞（CD68）,T细胞（CD3）,NK细胞（CD56）,巨噬细胞M2亚群（CD206）,验证CCT2表达与免疫微环境的关系。对小干扰RNA处理前后的食管癌细胞株进行高通量转录组测序,初步分析CCT2影响免疫微环境可能的分子机制,并通过多重微球流式免疫荧光发光法（Multiplex bead-based flow fluorescent immunoassay,MBFFI）检测细胞因子、Western blot 检测 MAPK/ERK 和 NFκB 通路的关键蛋白对机制进行初步验证。结果:CCT2 表达与 MDSC（P=0.000）,CD4+Th2（P=0.000）,巨噬细胞 M2 亚群（P=0.000）呈正相关,与NK细胞（P=0.004）,CD8+T细胞（P=0.003）,树突状细胞（P=0.000）呈负相关。临床样本验证显示,CCT2在M2型巨噬细胞高浸润组中表达明显增高（P=0.036）,在NK细胞高浸润组的表达量明显降低（P=0.037）。多因素分析显示,CCT2高表达的食管癌组织巨噬细胞M2亚群浸润显著增多（P=0.012）,并且不受到其他浸润免疫细胞的影响。转录组分析发现,CCT2敲除后的KYSE150细胞和野生型细胞株差异基因255个,下调189个,上调66个,差异基因富集于细胞因子和细胞因子相互作用通路、IL-17通路和TNF-α通路。CCT2下调后细胞培养液上清IL-6和TNF-α分别降低61%和82%（P＜0.05）,p-NFκB及p-ERK1/2蛋白显著下调（P＜0.05）。结论:CCT2可能通过MAPK/ERK和NFκB通路介导肿瘤相关的炎症反应,诱导肿瘤免疫抑制微环境的形成。第四章基于机器学习的多维数据分析在食管癌恶性食管瘘风险预测和预后中的应用第一节 食管癌患者恶性食管瘘风险因素的Meta分析目的:筛选食管癌患者食管瘘的危险因素,为后续风险预测模型构建提供参考和依据。方法:检索Pubmed和Embase数据库1990-2018年临床研究文献。使用“纽卡斯尔渥太华量表（Newcastle Ottawa scale,NOS）”评价文章的质量。采用Cochrane协作网提供的Revman 5.3软件进行Meta分析。结果:17篇文章符合纳入条件。这些文章共报道了 35个食管瘘形成的风险因素,对其中17个风险因素进行了 Meta分析。年龄（OR 2.34,95%CI:1.08-5.03,P=0.001）,溃疡型肿瘤（OR2.72,95%CI:1.43-5.16,P=0.002）,组织类型（OR4.16,95%CI:1.14-15.12,P=0.03）,T 分期（OR 2.66,95%CI:1.44-4.91,P=0.002）,短期疗效（OR2.21,95%CI:1.06-4.62,P=0.03）,化疗方案（OR2.80,95%CI:1.38-5.68,P=0.005）,狭窄（OR 2.00,95%CI:1.03-3.89,P=0.04）具有统计显著性。结论:年轻、溃疡型、鳞状细胞癌、T4期、不完全缓解、氟尿嘧啶为主方案、狭窄与放疗期间或放疗后食管瘘发生风险增加相关。第二节 基于机器学习的多维整合模型在食管癌恶性食管瘘风险预测中的应用目的:通过机器学习方法构建基于临床特征及影像组学的多维整合模型,评价其在食管瘘风险预测中的应用价值。方法:共纳入122例患者,将所有病例按照7:3比例随机分为训练集（n=86）和验证集（n=36）。Logistic回归分析筛选临床特征,构建临床预测模型作为对照。从食管癌治疗前的增强CT中提取影像组学特征,Lasso-logistic算法从中筛选出与食管瘘发生相关性最好的特征,特征和对应系数的线性组合计算影像组学标签（Radscore）。逻辑回归算法对筛选出的影像组学特征建立食管瘘的影像组学预测模型。临床独立风险因素及Radscore构建多维预测模型。在验证集中对模型的区分度、校准度、拟合优度、重分类能力及临床获益进行验证。结果:单因素分析筛选出狭窄（P=0.01）、性别（P=0.23）、T分期（P=0.11）均纳入多因素分析,结果显示狭窄是独立预测因素（P=0.023）。临床模型预测食管瘘发生,在训练集 AUC=0.691（95%CI:0.582-0.800）,验证集 AUC=0.640（95%CI:0.453-0.827）,AIC为115.8。Lasso回归从提取的851个影像组学特征中筛选出10个与食管瘘发生风险相关性最好的特征。单纯以影像组学特征构建的预测模型,验证集AUC=0.692（95%CI:0.516-0.868）,AIC为111.4。结合影像组学特征与临床独立风险因素构建的多维模型,预测效能明显提高,训练集AUC=0.782（95%CI:0.684-0.8796）,验证集 0.867（95%CI:0.746-0.987）,AIC=101.1,特异性95.2%,区分度显著优于影像组学模型和临床模型（Delong检验,P＜0.05）。决策曲线显示多维预测模型在各阈值概率下的净收益优于临床模型及影像组学模型。与临床模型相比,多维模型 NRI=0.236（95%CI:0.153-0.614）,IDI=0.125（95%CI:0.040-0.210）,P=0.004。结论:动脉期食管癌原发灶治疗前的CT影像组学特征可以作为标记物预测恶性食管瘘发生,基于临床特征和影像组学构建的模型有良好的预测效能。第三节 基于机器学习的多维整合模型在食管癌恶性食管瘘预后中的应用目的:通过机器学习方法构建基于临床特征及影像组学的多维整合模型,评价其在食管瘘预后预测中的应用价值。方法:收集76例食管瘘患者的临床病理数据,并获得治疗前、瘘发生后1月内的胸部强化CT。Cox回归分析筛选临床预后因素,终点指标为食管瘘患者总生存时间（OS1）及瘘后生存时间（OS2）。以独立预后因素建立临床预后模型。Lasso-Cox回归算法对影像组学特征进行筛选,特征和对应系数的线性组合计算影像组学标签（Radscore）。临床特征与Radscore构建多维食管瘘预后模型并验证。采用自举法进行内部验证,逐步回归的算法筛选出模型中最重要的自变量和系数,计算风险评分（Riskscore）,将患者根据风险评分分层,绘制生存曲线,比较不同风险组病人的生存情况。结果:多因素分析显示,年龄、前白蛋白、KPS和食管癌确诊到瘘发生时间为总中位生存期的独立预后因素（P＜0.05）,建立列线图预测模型,C指数0.719（95%CI:0.645-0.793）,自举法校正C指数0.688。年龄、前白蛋白、血浆白蛋白、KPS和中性粒细胞比例为瘘后中位生存期的独立预后因素（P＜0.05）,建立列线图预测模型,C指数0.722（95%CI:0.653-0.791）,自举法校正C指数0.686。瘘前强化CT的Lasso回归模型区分能力优于瘘后CT,使用瘘前强化CT的影像组学特征构建影像组学标签（Radscore）,与食管瘘总生存时间和瘘后生存时间均显著相关（P=0.000）。食管瘘总生存期和瘘后生存期多维预测模型的C指数分别为0.831（95%CI:0.757-0.905）,0.77（95%CI:0.686-0.854）自举法计算 C 指数分别为0.803,0.717。结论:1.动脉期食管癌原发灶治疗前的CT影像组学特征可以作为标记物预测恶性食管瘘的总生存期和瘘后生存期,基于临床特征和影像组学构建的模型有良好的预测效能。2.KPS、前白蛋白、食管癌确诊到瘘发生时间是食管瘘患者中位生存期的独立预后因素。年龄、前白蛋白、血浆白蛋白、KPS和中性粒细胞比例为瘘后中位生存期的独立预后因素。