黑曲霉作为国际公认的GRAS菌株广泛应用于有机酸、酶制剂及外源蛋白表达宿主等领域。真菌转录因子数据库(FTFD)中收录了775个经基因组测序预测的黑曲霉转录因子,这其中只有5%的转录因子通过传统方法进行了功能表征,大部分转录因子功能研究仍处于空白状态,并且其全基因组水平的转录因子结合位点信息及其调控机制研究甚少。在丝状真菌中,转录因子发挥关键的生物学调控功能,比如生长发育、细胞过程和刺激响应。因此解析其转录调控机制对于黑曲霉的宿主改造、遗传调控机制研究都具有重要价值。基于以上目的,本文主要以不同曲霉菌株为研究对象,为黑曲霉遗传调控位点的定向改造提供了新工具并结合高通量测序技术解析全基因组水平的不同类型转录因子的结合位点及其调控机制。具体研究内容及结果如下:(1)利用CRISPR/Cas9技术构建适合黑曲霉的单碱基编辑平台基于已有的基因编辑系统CRISPR/Cas9,将其活性蛋白Cas9失活成只具有单链切割活性的n Cas9,然后与胞嘧啶脱氨酶(r APOBEC1)和尿嘧啶核苷糖基化抑制子(UGI)融合成能在黑曲霉中正常表达且发挥碱基编辑功能的单碱基编辑系统。该系统可以通过碱基定点突变对基因完成氨基酸失活(pyr G和fwn A)或同义突变(fwn A),编辑效率为47.36%~100%,编辑窗口为2~9号碱基,为黑曲霉遗传改造、调控机制研究提供了定点编辑工具。(2)丝状真菌ATAC-seq技术开发探讨了液氮法、INTACT法和原生质体制备法三种方法在丝状真菌中开发ATAC-seq技术的可能性,确定原生质体制备是最优的方法。通过开发的ATAC-seq技术初步确定丝状真菌开放区信号分布特征,并结合RNA-seq确定染色质可及性与基因转录的关系。(3)丝状真菌染色质可及性研究通过分子生物学手段构建了黑曲霉转录因子cre A、amy R、cpc A、pac C和prt T敲除株和米曲霉lae A敲除和过量表达菌株。针对不同曲霉、不同培养条件和不同TF突变株构建ATAC-seq文库,研究多种条件下的染色质可及性变化规律。(4)黑曲霉转录因子的全基因组结合位点研究染色质可及性区域中存在大量反式作用因子与DNA顺式调控元件的相互作用。首先对可及性区域中已知Motif转录因子的酶切频率进行分析发现链切割不平衡性是判断TF结合位点的重要依据。使用ATAC-seq预测的DNA足迹与RNA-seq鉴定的差异表达基因对已知Motif转录因子进行了基因组水平的调控位点研究,确定Cre A、Amy R、Prt T和Pac C的调控功能,并使用人工设计的黑曲霉最小启动子进行了功能验证,确定其体内活性。随后使用HOMER软件对黑曲霉CBS513.88和SH2进行转录因子结合位点的从头预测,发现15和17个新型转录因子的结合基序,分析了其功能并进行体内验证。(5)蛋白酶调控因子Prt T的调控机制研究对构建的黑曲霉prt T突变株进行表征分析确定prt T与蛋白酶调控直接相关,其142号位苏氨酸不是影响活性的关键氨基酸位点,并且5’UTR区域中的u ORF存在翻译抑制作用;转录组测序表明Prt T涉及蛋白水解、氮源代谢调控等多种生物学功能,ATAC-seq足迹中鉴定到32个差异表达的蛋白酶基因中有8个被Prt T靶向调控。通过EMSA和敲除淀粉水解酶调控因子Amy R发现Prt T与Amy R的竞争性调控作用。