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β-胡萝卜素是维生素A的前体,被称为维生素A原,是一种重要的天然色素,具有抗氧化、抗衰老、防治心血管疾病的作用,以及抗癌和防治白内障等保健功效,同时也是理想的食品着色剂和营养增补剂,广泛应用于人造奶油、胶囊、饲料、化妆品等领域。本文通过对本实验室保藏的三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)进行物理化学诱变选育,获得稳定高产的β-胡萝卜素发酵菌株。然后运用统计学实验设计方法对发酵培养基和发酵条件进行优化研究,同时研究发酵过程的代谢调控,最终达到提高β-胡萝卜素产量的目的。具体研究内容如下:
(1)对出发菌株的培养基及培养条件进行了优化。得出最佳种子培养基为:玉米粉3%,大豆粉3%,KH2PO40.1%,MgSO40.02%,VB10.001%;种子培养条件:培养温度28℃,摇床转速200rpm,初始pH6.5,正负菌株种龄分别为20h和25h。通过优化试验得到的最适发酵培养基配方为:葡萄糖7.16%,麸皮浸出液4.08%,硫酸镁0.04%,大豆粉1%,KH2PO40.2%,大豆油3%,VB10.01%。对优化配方进行验证试验,β-胡萝卜素产量达到645mg/L。在使用优化后的发酵培养基情况下,采用单因素试验确定了出发菌株产β-胡萝卜素的最适发酵条件为:发酵液初始pH6,培养温度28℃,接种量9%,正负菌接种比例1:5,发酵时间144h,转速180rpm。
(2)对出发菌株负菌L-0进行了紫外诱变,确定了紫外照射最佳时间为10min,通过紫外诱变平板初筛和发酵复筛获得紫外诱变突变株UV-Ⅱ;对UV-Ⅱ进行紫外-氯化锂诱变,通过紫外-氯化锂诱变平板初筛和发酵复筛获得诱变突变株L-5。经发酵测定,L-5的β-胡萝卜素产量为1126mg/L,并通过遗传稳定性试验证明,L-5具有良好的遗传稳定性。
(3)通过对三孢布拉氏霉菌诱变菌株的培养基和培养条件的优化,得到了合适的发酵培养条件为:正菌种子培养时间为20h,负菌种子培养时间为25h,发酵时间为168h,接种量为9%,正负菌的接入比例为1:9,发酵初始pH值为6.5,发酵温度为28℃,摇床转速为180rpm。诱变后合适的发酵培养基为:葡萄糖浓度为9%、大豆粉浓度为0.3%,麸皮浸出液4%,KH2PO40.2%,硫酸镁0.05%,大豆油1%,VB10.001%。对优化配方进行验证试验,β-胡萝卜素产量达到1298mg/L。
(4)通过研究各种添加物对三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素的影响,找到提升β-胡萝卜素产量的有效因素:接种36h后添加30mg/L酮康唑、接种36h后添加0.1%β-紫罗酮、发酵培养基中添加0.1%的Span-20和1%正十二烷均有利于β-胡萝卜素合成。在摇瓶发酵获得优化后的培养基和培养条件的基础上经行15L机械搅拌式发酵罐放大培养,最优的转速和通气量分别为:100rpm和1.5vvm。
(1)对出发菌株的培养基及培养条件进行了优化。得出最佳种子培养基为:玉米粉3%,大豆粉3%,KH2PO40.1%,MgSO40.02%,VB10.001%;种子培养条件:培养温度28℃,摇床转速200rpm,初始pH6.5,正负菌株种龄分别为20h和25h。通过优化试验得到的最适发酵培养基配方为:葡萄糖7.16%,麸皮浸出液4.08%,硫酸镁0.04%,大豆粉1%,KH2PO40.2%,大豆油3%,VB10.01%。对优化配方进行验证试验,β-胡萝卜素产量达到645mg/L。在使用优化后的发酵培养基情况下,采用单因素试验确定了出发菌株产β-胡萝卜素的最适发酵条件为:发酵液初始pH6,培养温度28℃,接种量9%,正负菌接种比例1:5,发酵时间144h,转速180rpm。
(2)对出发菌株负菌L-0进行了紫外诱变,确定了紫外照射最佳时间为10min,通过紫外诱变平板初筛和发酵复筛获得紫外诱变突变株UV-Ⅱ;对UV-Ⅱ进行紫外-氯化锂诱变,通过紫外-氯化锂诱变平板初筛和发酵复筛获得诱变突变株L-5。经发酵测定,L-5的β-胡萝卜素产量为1126mg/L,并通过遗传稳定性试验证明,L-5具有良好的遗传稳定性。
(3)通过对三孢布拉氏霉菌诱变菌株的培养基和培养条件的优化,得到了合适的发酵培养条件为:正菌种子培养时间为20h,负菌种子培养时间为25h,发酵时间为168h,接种量为9%,正负菌的接入比例为1:9,发酵初始pH值为6.5,发酵温度为28℃,摇床转速为180rpm。诱变后合适的发酵培养基为:葡萄糖浓度为9%、大豆粉浓度为0.3%,麸皮浸出液4%,KH2PO40.2%,硫酸镁0.05%,大豆油1%,VB10.001%。对优化配方进行验证试验,β-胡萝卜素产量达到1298mg/L。
(4)通过研究各种添加物对三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素的影响,找到提升β-胡萝卜素产量的有效因素:接种36h后添加30mg/L酮康唑、接种36h后添加0.1%β-紫罗酮、发酵培养基中添加0.1%的Span-20和1%正十二烷均有利于β-胡萝卜素合成。在摇瓶发酵获得优化后的培养基和培养条件的基础上经行15L机械搅拌式发酵罐放大培养,最优的转速和通气量分别为:100rpm和1.5vvm。