【摘 要】
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大部分体外培养细胞寿命是有限的,当细胞的存活状态不好时将影响研究进展的推进,并且有些细胞因采样和纯化困难较为难得,因此,建立永生化细胞成为了可以为科学研究提供稳定细胞系的一种手段。马是一种采样较难的动物模型,而随着我们团队马繁殖与发育生物学相关课题的开展,获得马永生化细胞系成为了一种研究需求,由此,在本研究中我们通过向原代培养蒙古马胎儿成纤维细胞（Equine Fetal Fibroblast,E
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大部分体外培养细胞寿命是有限的,当细胞的存活状态不好时将影响研究进展的推进,并且有些细胞因采样和纯化困难较为难得,因此,建立永生化细胞成为了可以为科学研究提供稳定细胞系的一种手段。马是一种采样较难的动物模型,而随着我们团队马繁殖与发育生物学相关课题的开展,获得马永生化细胞系成为了一种研究需求,由此,在本研究中我们通过向原代培养蒙古马胎儿成纤维细胞（Equine Fetal Fibroblast,EFF）过表达被多个物种证明有效的人端粒酶逆转录酶催化亚基（Human telomerase reverse transcriptase,hTERT）,探索了建立永生化蒙古马成纤维细胞系的可能性,为后续研究奠定基础。本研究主要由以下三部分组成:1.对冲胚技术获得34天的马胎儿利用胶原酶Ⅳ消化分离法纯化获得呈不规则三角形、纺锤形、卵圆形细胞核、边缘清晰、生长旺盛、旋涡状或平行排列生长的蒙古马EFFs,经体外培养证明其正常可传17代,同时为后续实验铺垫,我们利用纯化获得的蒙古马EFFs确定了该细胞上潮霉素B最佳筛选浓度为50μg/m L。2.利用表达hTERT和潮霉素抗性的pLV-hTERT-IRES-hygro慢病毒感染蒙古马EFFs,经50μg/m L潮霉素B筛选,得到阳性细胞hTERT-EFFs。显微镜下观察证明其细胞形态正常,RT-PCR检测则证明了感染成功,外源hTERT m RNA可一直在细胞内稳定表达。该细胞能够传代30代以上,有效地延长了现有实验室体外培养体系下细胞的传代次数。然而,CCK-8法测生长曲线证明hTERT-EFFs增殖能力显著低于EFFs（P＜0.05）,流式细胞仪检测细胞凋亡也证明hTERT-EFFs凋亡率显著高于EFFs（P＜0.05）,同样β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老也证明hTERT-EFFsβ-半乳糖苷酶染色阳性率较高。3.通过查阅文献我们推测hTERT-EFFs的体外传代次数虽然提高了,但是细胞质量下降的原因可能是人来源的hTERT与马的端粒酶基因（Telomerase RNA Gene,TERC）不相容。为进一步判定这一推测,我们分别对比了多物种的TERT核苷酸、蛋白和TERC序列,结果表明TERT核苷酸序列与蛋白序列在多物种中高度相似,而物种间TERC关键位点存在的差异,我们认为这可能是导致hTERT-EFFs中人源TERT和马源TERC不相容,进而影响细胞质量的根本原因。综上所述,本研究证明了为获得马永生化细胞仅过表达hTERT是不足够的,并指出有必要将过表达马来源TERT或共表达hTERT和hTERC作为后续策略。该研究为马成纤维细胞永生化细胞系的真正建立打好了必要的实验室方法和数据基础。
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