米曲霉、黑曲霉是目前工业上常用的曲霉属真菌菌株,且因为其悠久的驯服历史及较高的食品安全性,在我国广泛应用于食品酿造行业。目前常用育种方法为传统的诱变及原生质体融合方法,具有不确定性和盲目性,且需大规模的筛选工作。Cas9-sg RNA核糖核蛋白（ribonucleoprotein complexes,RNP）复合物的转化属于DNA-free的方式,脱离了传统的转基因的范畴,且降低了脱靶作用,可以达到食品级定向育种的目的。本论文通过使用促溶标签、多重启动子策略优化了Sp Cas9蛋白在大肠杆菌中的表达,实现了Sp Cas9蛋白的高效可溶性表达。并探索可实现DNA-free的基于CRISPR系统的RNP递送方式在曲霉属中应用的可行性。并通过探究米曲霉中蛋白酶转录调控因子PrtT基因启动子5’UTR的uORF,找出适合进行食品酿造的育种位点,探究RNP递送方式在米曲霉育种的可行性。主要研究内容如下:（1）在大肠杆菌中通过比较GB1促溶标签与Sp Cas9蛋白的连接方式,筛选出最适合Sp Cas9蛋白的表达方式。当GB1通过linker连接在Sp Cas9蛋白的C端时,显著的提高了Sp Cas9蛋白的表达量及可溶性,为未融合GB1的Sp Cas9蛋白的表达量的1.68倍,Sp Cas9-CGB1蛋白在上清中的表达量为破碎全液的1.11倍。（2）在大肠杆菌表达中,比较多个T7启动子串联对下游蛋白表达的影响。二重、三重、四重T7启动子均可以提高表达量,且三重和四重T7启动子对于目的蛋白的表达量提高量相差不大。四重启动子驱动下表达量为一重T7启动子驱动下NGB1-Sp Cas9蛋白的表达量的1.82倍,三重启动子驱动下表达量为一重T7启动子驱动下NGB1-Sp Cas9蛋白的表达量的1.66倍。综合GB1促溶标签及多重启动子策略,得到了较一重T7启动子驱动下Sp Cas9-CGB1蛋白的表达量的1.50倍的目的蛋白。且纯化得到的Sp Cas9-CGB1具有正确活性。（3）在曲霉模式菌株黑曲霉中探究RNP递送方式对于基因编辑的可行性。选用常用营养缺陷型基因pyr G作为研究对象进行RNP转化体系的建立。实验结果表明RNP递送方式可在黑曲霉中进行基因编辑,在切割位置引入indel的转化子大约为9/12,RNP在曲霉中进行编辑效率约为75%。（4）为寻找米曲霉中适合进行育种的位点,选择了蛋白酶转录调控因子PrtT作为研究对象。通过调查发现确实PrtT影响到分泌蛋白酶的表达且PrtT转录调控因子可能主要调控碱性蛋白酶alp A及中性蛋白酶NPⅠ。并通过Gus基因酶活力的测定,验证成功了预测的PrtT基因启动子5’UTR中的uORF20,在移码突变uORF20时可以在翻译层面提高下游报告基因的酶活力,该位点可以作为CRISPR/Cas9基因组编辑系统的育种编辑位点,并在米曲霉中我们使用Cas9-sg RNA的RNP复合物编辑对uORF20及营养缺陷型基因pyr G基因进行编辑尝试。