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研究目的利用新型打击器(大鼠脊髓精密打击器(68099H))建立脊髓损伤后神经病理性疼痛的动物模型。利用免疫荧光及Western-blot观测NG2细胞及其蛋白-硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)的表达。初步研究探讨NG2细胞在参与脊髓损伤后神经病理性疼痛产生机制中可能发挥的作用。研究方法选择成年雄性Sprague-Dawlye大鼠75只,体重220~250g。随机分为三组:对照组(Control组,n=15),不做任何处理;假手术组(Sham组,n=30),手术暴露脊髓T10后直接缝合切口;脊髓损伤后神经病理性疼痛模型组(SCI组,n=30),手术暴露脊髓T10后利用新型精密打击器打击T10建立脊髓损伤后神经性疼痛模型。(1)观察大鼠伤前1d及伤后14d、21d、28d后肢机械痛阈的情况,评估其疼痛模型是否构建成功,并于伤前1d及伤后1d、3d、7d、14d、21d、28d通过BBB评分对大鼠脊髓损伤后的运动功能进行评估,并在相关时间点做HE染色观察病理变化情况。(2)在第一步实验的基础上,取4个关键时间点的脊髓组织做免疫荧光染色,观察NG2细胞的增殖及活化情况。(3)在第一步实验的基础上,利用Western-blot观察4个关键时间点CSPG的表达。(4)统计学分析:采用SPSS24.0软件进行,p<0.05认为差异具有统计学意义。研究结果1大鼠脊髓损伤后机械痛阈、BBB评分及HE染色情况(1)各组大鼠伤前BBB评分的差异均无统计学意义(p>0.05)。SCI组大鼠伤后1d的BBB评分均为0分,伤后3d、7d、14d、21d、28d呈上升趋势,分别为(0.43±0.56)、(4.03±1.00)、(10.93±1.23)、(15.57±1.65)及(18.23±1.41),差异有统计学意义(F=1583.982,p<0.001);两两比较任意两个时间点比较差异均有统计学意义(p<0.05)。BBB评分的变化趋势SCI组与Control组、Sham组差异均有统计学意义(p<0.001)。Control组与Sham组大鼠伤后各时间点BBB评分的差异无统计学意义(p>0.05)。(2)各组大鼠伤前后肢机械痛阈的差异无统计学意义(p>0.05)。SCI组伤前1d及伤后14d、21d、28d的机械痛阈呈先下降、伤后21d回升并维持的趋势,分别为(16.33±2.40)g、(7.87±1.04)g、(9.87±1.57)g及(10.13±1.38)g,差异有统计学意义(F=267.833,p<0.001),两两比较除了伤后21d与伤后28d之间差异无统计学意义(p>0.05),其余任意两个时间点比较差异均有统计学意义(p<0.05)。Control组与Sham组大鼠各时间点的机械痛阈值差异均无统计学意义(p>0.05)。机械痛阈变化率SCI组与Control组、Sham组差异均有统计学意义(F=37.441,p<0.001),SCI组明显大于Control组与Sham组(p<0.05),而Control组与Sham组间差异无统计学意义(p>0.05)。(3)伤后14d,HE染色可见脊髓胶质细胞大量浸润;伤后21d胶质细胞大量分化增生;伤后28d大量的胶质纤维生成。2大鼠脊髓损伤后神经病理性疼痛模型的NG2细胞活化与增殖(1)SCI组伤前1d及伤后14d、21d、28d的NG2细胞数量及占比呈先上升,在伤后14d达到高峰,伤后21d回降并维持的趋势,分别为(40.60±8.68个;4.53±0.50%)、(184.10±41.38个;16.63±1.59%)、(123.90±18.78个;12.19±2.37%)、(114.00±30.90个;11.96±2.13%)。各时间点NG2细胞数占比差异有统计学意义(F=919.505,p<0.001);两两比较除了伤后21d与伤后28d之间差异无统计学意义(p>0.05),其余任意两个时间点比较差异均有统计学意义(p<0.05)。(2)荧光显微镜下可见伤后14d NG2细胞胞体轻度增大,伤后21d胞体明显增大,胞体突触增加;伤后28d胞体大小及胞体突触情况无明显改变。伤前1d及伤后14d、21d、28d的NG2细胞荧光强度分别为1.00、1.49、1.64及1.58。3各组大鼠脊髓组织的CSPG表达情况Western-blot检测结果显示,SCI组伤前1d及伤后14d、21d、28d的CSPG早期呈先上升、并于伤后21d下降并维持的趋势,分别为(1.00±0.06)、(1.49±0.26)、(1.38±0.18)及(1.43±0.16),差异有统计学意义(F=40.285,p<0.05)。两两比较除了伤后21d与伤后28d之间差异无统计学意义(p>0.05),其余任意两个时间点比较差异均有统计学意义(p<0.05)。脊髓损伤后NG2细胞增殖与活化与脊髓组织CSPG表达呈现正相关(r=0.964,p<0.05)。脊髓组织CSPG表达量SCI组(1.42±0.16)、Control组(1.00±0.09)和Sham组(0.93±0.07)三组之间差异有统计学意(F=2603.225,p<0.05);其中SCI组较Control组和Sham组CSPG表达量明显增加(p<0.05);Sham组与Control组CSPG表达量差异无统计学意义(p>0.05)、研究结论(1)利用新型打击器(大鼠脊髓精密打击器(68099H))可建立数字化、重复性和观测性良好的脊髓损伤后神经病理性疼痛的动物模型,该模型具有可以避免传统重物下坠法造模时重物弹跳而形成继发性损伤的影响的优势。(2)胶质细胞增殖与活化情况与大鼠脊髓损伤后的行为学相对应。(3)大鼠脊髓损伤后2周内为急性疼痛期,并于伤后3周开始转向慢性疼痛期并维持。(4)大鼠脊髓损伤后NG2细胞的增殖与活化逐步增加,并于损伤后2周达到增殖高峰,损伤后3周活化程度最强,损伤后4周维持稳定状态。脊髓组织CSPG表达与NG2细胞增殖与活化呈现正相关。(5)NG2细胞可能在脊髓损伤后神经病理性疼痛产生机制中发挥重要作用。