龋病是一种危害人类健康的重要口腔常见病，牙菌斑生物膜作为龋病发生的始动因子，复杂的三维立体结构为存活于其中的微生物提供了良好的生存环境。经过100多年的历程，人们对于微生物的致龋机制有了逐步深入的研究，先后提出了非特异菌斑假说、特异菌斑假说、生态菌斑假说、连续流假说。本课题组前期横向和纵向研究了不同龋敏感儿童口腔微生物组的多样性变化，研究显示部分公认致龋菌（如变异链球菌）的检出率和数量与龋病不存在正相关关系，推断龋病发生可能是菌斑中不同细菌综合作用的结果，尚需进一步探索致龋微生物在龋病发生过程中的动态演替及某些致龋菌在不同龋易感人群中的空间分布变化。观察微生物的动态变化难以在人体口腔实现，只能通过动物模型得以实现。变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient glegectrophoresis，DGGE)技术在分析微生物的多样性及动态性变化方面具有优越性，较传统的菌种分离培养技术能更快捷并鉴定出不可培养细菌。荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)结合(confocal laser scanningmicroscopy，CLSM)，集合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性，被广泛应用于揭示微生物的原位生理学特性和功能，现已成为微生物分子生态学研究的重要技术手段。本课题组采用PCR-DGGE与FISH结合CLSM技术研究菌斑微生物在龋病发生过程中的动态变化及观察不同龋易感人群相关细菌的空间变化。　　 目的:本实验纵向研究Wistar大鼠菌斑样本在龋病发生过程中部分致病菌的动态变化，并以高龋和无龋开放人群为研究对象，观察两种检出率高、有代表性的口腔微生物（包括变异链球菌、具核梭杆菌）在牙菌斑生物膜中的差异变化及空间分布。结合前期研究结果，比较患龋前后牙菌斑微生物的演替情况及多样性改变，探究变异链球菌和具核梭杆菌对龋病发生的影响及其在菌斑生物膜形成过程中的作用，全面系统评价牙菌斑生物膜中微生物与龋病发生的相关关系。　　 方法:(1)18天龄雄性Wistar大鼠随机分成A，B，C，D致龋平行组和E，F两组对照平行组，每组6只。其中致龋组喂养致龋饲料2000#及5％葡萄糖水;对照组喂养普通饲料。每周采集菌斑样本分别提取混合菌斑DNA，PCR扩增16S rDNA的V3-V5区，扩增产物进行DGGE，选取特异条带克隆、测序，序列比对。Quantity One软件对各条带位置峰值、缺失等情况进行数字化分析，所得数据矩阵进行聚类分析，SPSS软件方差分析牙菌斑相关龋病微生物多样性的动态变化。　　 (2)符合WHO标准的5名高龋和5名无龋健康成年人，制作“口内菌斑培植器”获得原位牙菌斑，在1，2，3，5，7天行变异链球菌、具核梭杆菌和通用细菌的特异性寡核苷酸探针荧光原位杂交，激光共聚焦显微镜下观察牙菌斑生物膜中变异链球菌和具核梭杆菌的空间分布及演替变化。Image J软件分析，多因素方差分析及Tukey和SNK检验等分析不同龋易感人群牙菌斑生物膜厚度和两种靶细菌的差异变化。　　 结果:(1) DGGE图谱显示13个优势条带，经克隆、测序及序列比对结果显示柄木槿假单胞菌，嗜麦芽窄食单胞菌，枯草芽孢杆菌，弗氏志贺菌，Cupriavidus metallidurans等优势菌。嗜麦芽窄食单胞菌在龋病的发生发展过程中，有明显的差异性变化，是否与龋病存在负相关关系，有待进一步研究。聚类分析发现，致龋组与无龋组聚成3簇，致龋A、B组聚成一簇，C、D、E三组聚成一簇，F单独成簇。　　 (2)龋病发生过程中，致龋组总体趋势菌群多样性有所下降且条带均值高于无龋组，条带最多为13.5±1.7，最少为8.0±2.5，均值为11.2±2.2;对照组条带最多为15.0±0.0，最少为5.0±0.0，均值为10.6±3.1。致龋组在第1-11周时间内，条带数目均值分别为8.0±2.5～13.5±1.7;对照组条带数目均值分别为5.0±0.0～15.0±0.0。同一时期内两组菌群多样性无明显差异。　　 (3)牙菌斑生物膜形成1，2，3，5，7天的过程中，无龋组变异链球菌的百分含量分别为34.3％，30.1％，16.2％，48.8％，35.1％;高龋组变异链球菌的百分含量分别为11.6％，36.0％，25.3％，22.6％，32.7％。无龋组中生物膜在第1天和5天的观察时间内变异链球菌百分比含量均明显高于高龋组(P＜0.05)。　　 (4)具核梭杆菌在无龋组和高龋组的百分含量分别为4.7％，7.6％，15.1％，37.6％，26.5％和2.1％，23.4％，5.7％，4.6％，18.1％。无龋组具核梭杆菌的百分含量基本保持增长状态，只在第7天时有所下降但明显高于第一天的百分含量(P＜0.05)。高龋组具核梭杆菌的百分含量在第2，3天时有明显上升和下降趋势(P＜0.05)，第7天表现上升趋势。无龋组中具核梭杆菌的百分比在生物膜的1;3，5天时明显高于高龋组(P＜0.05)。　　 (5)在牙菌斑生物膜形成期间，两组受试对象的牙菌斑生物膜的平均厚度都呈现随时间不断上升趋势。无龋组的生物膜平均厚度变化范围为17.9±5.6um～43.0±10.8um，高龋组生物膜平均厚度变化范围为27.5±7.5um～44.9±7.2um。结果发现两组菌斑生物膜在第5，7天时，相对于各自第1天的生物膜厚度均有明显上升趋势(P＜0.05)。同一时间内两组受试者的生物膜厚度只有在1天时存在差异，无龋组生物膜厚度明显高于高龋组(P＜0.05)。　　 (6)激光共聚焦扫描显微镜成像显示，牙菌斑生物膜呈现三维立体结构，形态多样。菌斑生物膜形成初期，变异链球菌占据优势数量，贯穿牙菌斑生物膜的全层，具核梭杆菌主要位于生物膜的中层，在牙菌斑生物膜的底层几乎不见或者很少。　　 结论:(1)体外构建动物模型模拟人类口腔环境，纵向研究龋病发生过程部分菌斑微生物的动态变化与人类口腔的真实环境仍存在一定的差异。龋病发生过程中，菌斑微生物多样性构成下降但高于无龋组。(2)变异链球菌和具核梭杆菌在菌斑生物膜形成的不同时期，构成比并非一成不变。高龋组变异链球菌的检出数量与龋病不成正相关关系，与龋病的关系需要进一步研究。具核梭杆菌在无龋组中数量保持增长，尚需进一步探索具核梭杆菌在人类口腔中发挥的作用。