性腺是脊椎动物生殖繁衍的关键器官,性腺发育是一个极为复杂的生物学过程,相关基因功能及作用机制的解析一直是研究的热点和难点。颅面畸形是一种常见的软骨发育相关疾病,研究软骨发育的调控机理对阐释人类(Homo sapiens)疾病的发生机制具有指导意义。Sox(Sry-related HMG-box)家族是一类与哺乳动物Y染色体上的性别决定基因Sry(Sex determination region of Y chromosome)紧密相关的编码转录因子的基因家族。Sox9是Sox转录因子家族的一个重要成员,在脊椎动物性别决定及分化、性腺发育和软骨细胞分化及形成等过程中具有关键作用。在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,以下简称罗非鱼)等硬骨鱼类中,Sox9因为全基因组复制而形成Sox9a和Sox9b两个拷贝。前期基于罗非鱼性腺转录组数据分析发现,Sox9a在雌雄性腺发育早期的表达较低,后期基本不表达;Sox9b在早期表达水平也较低,孵化后90天(90 day after hatching,90 dah)和180 dah时的精巢中表达水平明显上升。但是,Sox9a和Sox9b在罗非鱼雌雄性腺中的亚细胞表达定位及功能还有待阐明,而在软骨等其他组织中的表达特征和功能研究还是一片空白。本研究采用原位杂交方法系统分析了罗非鱼Sox9a和Sox9b基因在性腺和软骨中的表达特征,进一步采用CRISPR/Cas9基因敲除技术分别对罗非鱼Sox9a和Sox9b基因进行了敲除,并通过个体形态观察、组织学分析、EdU染色及基因表达检测等实验,重点探究了Sox9a和Sox9b在罗非鱼性腺及软骨发育中的功能及作用机制。主要研究结果如下:1)罗非鱼Sox9基因的时空表达特征应用荧光原位杂交实验(Fluorescence in situ hybridization,FISH)对罗非鱼Sox9基因的两个拷贝在不同发育阶段雌雄罗非鱼性腺中的表达模式进行了分析。结果显示,Sox9a在5 dah的表达水平较低,且主要在生殖细胞周围的体细胞表达;在20 dah和30dah时的表达明显升高,定位于体细胞且雌雄没有明显差异;在60 dah及以后几乎检测不到其表达。Sox9b基因在5 dah和30 dah时主要在生殖细胞周围的体细胞中表达,表达水平较低且雌雄没有明显差异;在90 dah和180 dah时表达水平升高,且主要表达于精巢生殖细胞周围的体细胞。此外,我们以仔鱼期罗非鱼为材料分析了Sox9基因在软骨形成关键时期即3 dah时的表达特征。全胚原位杂交实验(Whole-mount in situ hybridization,WISH)结果显示,Sox9a在罗非鱼颅面软骨、胸鳍、脊椎软骨和尾芽软骨中的表达水平较高;Sox9b在脑中高表达,而在软骨组织中只有少量表达。2)Sox9a和Sox9b在罗非鱼性腺发育中的功能鉴于Sox9a和Sox9b在罗非鱼性腺中的表达差异,本研究应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对罗非鱼Sox9a和Sox9b分别进行了缺失突变。在获得Sox9a基因的纯合突变鱼后,进一步通过免疫荧光分析发现,在性别决定关键时期即5 dah时,Sox9a纯合突变雌鱼性腺中能检测到卵巢高表达因子Cyp19a1a的表达,雄鱼性腺中有精巢高表达因子Gsdf的表达,而且两者的荧光信号强度与野生型鱼没有明显差异。这暗示Sox9a可能不参与罗非鱼的性别决定与分化。为探究Sox9a纯合突变对罗非鱼性腺中生殖细胞增殖的影响,我们分别在生殖细胞刚开始增殖的时期(8 dah)以及持续增殖时期(12 dah、16 dah和20 dah),用生殖细胞特异的Vasa抗体分别标记野生型、Sox9a杂合突变及Sox9a纯合突变鱼性腺的生殖细胞,并对生殖细胞数量进行了统计。结果显示,与对照相比,Sox9a纯合突变鱼性腺生殖细胞的数目在8 dah和12 dah时没有明显差异,而雌雄鱼性腺生殖细胞在16 dah和20 dah明显减少。进一步用显示细胞DNA复制及增殖情况的EdU染色实验分析发现,15 dah时野生型雌雄鱼性腺中部分体细胞有明显的EdU信号,表明这些细胞正在进行增殖;而Sox9a纯合突变鱼性腺体细胞中几乎没有阳性信号。我们综合分析推测,Sox9a主要参与调控稚鱼期罗非鱼性腺中生殖细胞周围体细胞的增殖,进而间接影响生殖细胞的增殖。由于Sox9a纯合突变鱼在20 dah时即死亡,我们进一步对Sox9a杂合突变罗非鱼发育后期的性腺发育情况进行了分析。在180 dah,Sox9a杂合突变雄鱼性腺成熟系数(Gonadal somatic index,GSI,性腺重/体重×100%)显著降低。组织学观察显示精巢中的精原细胞数量显著增加,精母细胞、精子细胞和精子的数量显著减少。同时real-time PCR结果显示Sycp3和Vasa的表达显著下降,而eEF1A1b的表达显著升高。这些结果进一步证明了Sox9a在生殖细胞有序增殖和维持中发挥作用。同时,本研究成功获得了Sox9b杂合突变的罗非鱼。考虑到Sox9b在罗非鱼精巢中高表达,本研究重点分析了Sox9b杂合突变对罗非鱼精巢发育的影响。组织学观察发现,90 dah时的野生型雄鱼的精巢中已经出现精母细胞(减数分裂已起始),而Sox9b杂合突变雄鱼精巢中只有精原细胞;在150 dah时,Sox9b杂合突变鱼精巢已经出现各级的生精细胞。这些结果表明Sox9b杂合突变可能只是导致精巢生殖细胞减数分裂起始的延迟而非阻断这个过程。3)Sox9a在罗非鱼软骨发育中的功能鉴于罗非鱼Sox9a在各种软骨组织中高表达,本研究进一步分析了Sox9a突变对罗非鱼软骨发育的影响。结果发现,Sox9a纯合突变鱼的颅面发育畸形,不能正常进食,在20 dah左右死亡。10 dah时的形态学观察和阿利新蓝染色发现,Sox9a纯合突变鱼颅面骨发育严重畸形,主要是麦克尔氏骨及第1至第3鳃弓缺失,从而导致颅面骨形态发生明显改变;进一步在5 dah(类骨质沉积和钙化过程)时用活体中络合钙离子的荧光染料(钙黄绿素)染色发现,纯合突变仔鱼颅面软骨中的下颌骨缺失,上颌骨变形;一部分纯合突变仔鱼出现脊柱弯曲,尾芽骨变小和弯曲。这表明Sox9a在罗非鱼软骨发育中发挥了重要调控作用。通过3 dah时期的全胚原位杂交实验发现,软骨细胞分化标记基因Col2a1a在野生型罗非鱼的颌骨、颅骨和胸鳍中高表达,这与Sox9a在软骨中的表达模式类似。但是,Col2a1a在Sox9a纯合突变鱼颅面软骨中的表达明显下调,表明Sox9a可能通过上调Col2a1a的表达来调控颅面软骨的正常发育。综上所述,本研究证明了Sox9在罗非鱼性腺和软骨发育中的细胞定位,揭示了Sox9a对体细胞和生殖细胞的增殖和维持具有重要作用,但不参与性别决定与分化,并且通过调控Col2a1a的表达影响罗非鱼颅面软骨的正确形成;Sox9b可能对正确起始精巢生殖细胞减数分裂具有重要作用。本研究丰富和完善了Sox9在硬骨鱼类乃至脊椎动物性腺和软骨发育中的作用。