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精氨酸脱亚氨酶(Arginine deiminase,ADI)途径广泛地存在于细菌、古生菌以及少数低等真核生物中,主要参与厌氧及兼性厌氧生物的精氨酸的代谢过程。目前,在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌等好氧类型的微生物中尚未发现存在ADI途径。一般认为,ADI途径的生理功能主要是为厌氧条件下微生物生长提供能量并维持细胞内环境的稳定。虽然ADI途径广泛分布于原核生物中,但已有的多项研究表明编码ADI途径的操纵子的基因组成及其调控方式存在多样性。目前,ADI途径在蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)中的作用及调控方式未见报道,研究蜡样芽孢杆菌的ADI途径不仅有助于理解该细菌的精氨酸代谢途径,而且对于揭示精氨酸代谢与细菌的环境适应机制的关系具有重要价值。本研究首先将蜡样芽孢杆菌(B.cereus)0-9的基因组进行重测序,将得到的0-9基因组序列利用生物学软件进行分析比对发现0-9基因组中存在与ADI途径相关的基因,利用相关生物信息学手段及同源重组原理敲除了与精氨酸合成相关的基因argG以及在细菌中常被用于在厌氧情况下代谢精氨酸的ADI蛋白编码的基因arcA。同时获得了arcA与argG基因的双敲除菌株。将得到基因缺失菌株在盐胁迫、在厌氧条件下的生长、生物膜形成、胞外蛋白酶与胞外淀粉酶产生能力以及细菌的定殖能力等性状与与0-9野生型菌株进行比较。结果发现,基因arcA的缺失使0-9产胞外蛋白酶、胞外淀粉酶以及产生物膜的能力减弱,基因argG的缺失使菌株产生物膜能力减弱,产胞外淀粉酶能力增强。测定高盐以及厌氧条件下0-9及其衍生菌株的群体生长能力,发现在低盐条件下(含1%NaCl的LB培养基),几个基因缺失菌株与0-9野生型无明显差别,高盐条件下(含4%NaCl的LB培养基),几个基因缺失菌株的生长状况均明显比0-9野生型差,说明arcA及argG基因的缺失导致0-9对盐更敏感,为了进一步确定此结论,通过提取0-9在低盐及高盐条件下不同时期的总RNA,采用RT-PCR技术测定arcA基因的表达量,发现在高盐条件下,arcA基因的表达量升高,此结果进一步表明arcA的影响了 0-9的盐胁迫响应。测定菌株在有氧与厌氧情况下的群体生长,发现在有氧条件下,arcA与argG基因的缺失菌株及双敲除菌株与0-9野生型野生型无明显差别,而在厌氧条件时,基因缺失型菌株的生长状况均明显比0-9野生型差,加入精氨酸后,ΔarcA基因敲除型菌株及arcA及aargG基因的双敲除菌株在对数期的生长有所恢复,但稳定期时较0-9的生物量仍然偏低,而argG基因敲除型菌株几乎恢复到与0-9野生型一致,说明arcA及argG基因参与0-9菌株在厌氧情况下的生长,为了进一步确定基因arcA影响0-9厌氧生长,提取0-9在正常通气厌氧情况下不同时期的总RNA,采用RT-PCR技术测定arcA基因的表达量,发现在厌氧情况下,arcA的基因表达量升高,此结果进一步表明arcA影响了 0-9在厌氧情况下的生长,同时,这一结论表明了在B.cereus 0-9中,ADI途径参与0-9厌氧生长。测定ΔarcA、ΔargG以及双基因敲除菌株与0-9野生型菌株在小麦根系的定殖能力,发现ΔarcA、ΔargG及ΔarcAΔargG在小麦中的定殖能力均明显低于0-9,说明arcA及argG参与0-9在土壤中对小麦的定殖。利用蛋白表达及纯化以及ADI酶活测定方法,验证了arc 基因编码的蛋白具有ADI蛋白活性。测定ΔarcA及其互补菌株的表型,发现其互补菌株在生物膜形成能力、蛋白酶产生能力、厌氧情况下的生长能力方面基本互补成功,进一步证明了arc 基因的表达情况影响了 0-9的生物膜形成能力,胞外蛋白酶产生能力、胞外淀粉酶产生能力,厌氧情况下的生长能力。本研究通过测定基因arcA与argG与缺失对蜡样芽孢杆菌(B.cereus)0-9的生理功能的影响,初步了解了 arcA与argG在蜡样芽孢杆菌(B.cereus)0-9中的作用,为以后揭示精氨酸合成与代谢对细菌的环境适应机制的作用奠定了一定的理论基础。