目的 次级淋巴组织趋化因子(secondarylymphoidtissuechemokine，SLC)又称为CCL21(CCchemokineligand21)、6Ckine、exodous2、TCA4等，是趋化因子家族CC亚族中的成员，对多种免疫细胞具有趋化作用。研究表明，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用的免疫细胞，包括T细胞、B细胞、DC和NK细胞，膜表面均表达SLC的受体CCR7。SLC通过与CCR7结合，募集免疫细胞向肿瘤局部迁移、浸润，刺激它们产生IFN-γ、GM-CSF、IL-12等细胞因子，增强非特异性免疫，抑制肿瘤血管生成，因而具有显著的抗肿瘤作用，是目前肿瘤免疫治疗的理想效应分子。研究证实，重组蛋白SLC瘤内注射能产生较强的抗肿瘤免疫效应，并抑制肿瘤的生长。然而，SLC蛋白注射疗法不可避免的具有反复、多次、大剂量注射所带来的副作用，且效果不持久。 为了深入研究SLC对免疫细胞的趋化活性、促增殖作用及在抗肿瘤作用中的地位，探索SLC基因免疫治疗肿瘤的有效途径，本实验拟构建含小鼠SLC全长cDNA序列的真核表达载体，通过电穿孔法，以其转染COS-7细胞，研究小鼠SLC在体外的瞬时表达，为进一步利用小鼠SLC基因免疫治疗肿瘤的实验研究奠定基础。但是，用单独的SLC基因治疗时，存在局部浓度低、作用时间短的缺点，抗肿瘤的作用也有限：若与其它基因联合应用时，SLC基因可表现出较强的抗肿瘤效应。因此，可选择与SLC基因具有协同或/和互补免疫调节作用或/和抗肿瘤作用的细胞因子基因及协同刺激分子基因，联合进行基因治疗。 IL-2能作用于T细胞、B细胞、DC及NK细胞等，促进细胞增殖并诱导细胞分泌IFNα、IL-4、TNF和CSF等细胞因子，同时还可增强CTL的细胞毒活性、激活NK、LAK细胞的直接杀伤作用等，有效地扩增针对肿瘤抗原的B细胞及T细胞应答，常用于恶性肿瘤的免疫治疗。SLC和IL-2在激发机体特异和非特异抗肿瘤免疫应答方面均具有重要功能，可分别作用于抗原提呈细胞和免疫效应细胞，发挥协同抗肿瘤效应。 本实验中，我们拟通过PCR的方法克隆hSLC基因片段，然后将其插入到真核表达载体pIRES的多克隆酶切位点中，使hSLC基因置于能在真核细胞中高效表达的CMV启动予调控之下，构建重组真核表达载体pSLC-IRES。我们以具有双基因共表达特性的IRES相连处于同一启动子控制下的hSLC和hIL-2，构建高效表达SLC和IL-2的共表达质粒pSLC-IRES-IL-2，并探讨表达的SLC和IL-2在抗肿瘤基因治疗中的协同效应，为进一步运用该共表达质粒对肿瘤进行基因治疗的实验研究提供依据。 研究内容及方法 1.重组共表达载体pSLC-IRES-IL-2的构建及在COS-7细胞中的表达 (1).用PCR扩增SLC基因。 (2).以亚克隆技术构建重组载体pSLC-IRES，并酶切鉴定。 (3).采用异硫氰酸胍一步法提取Jurkat细胞的总RNA。以提取的总RNA为模板，RT-PCR扩增IL-2基因。 (4).采用TA克隆技术构建克隆载体pMD-hIL-2，酶切鉴定并测序。 (5).利用亚克隆技术，构建共表达质粒pSLC-IRES-IL-2，酶切鉴定。 (6).采用电穿孔法，以共表达质粒pSLC-IRES-IL-2转染COS-7细胞。 (7).Westernblot检测重组蛋白表达 。2.小鼠SLC真核表达载体pVAX1-mSLC的构建及瞬时表达。 (1).利用亚克隆技术，构建重组载体pVAX1-mSLC，并酶切鉴定。 (2).采用体外电穿孔法转染COS-7细胞。 (3).Westernblot检测重组蛋白表达。 结果 1.重组共表达载体pSLC-IRES-IL-2的构建及在COS-7细胞中的表达 (1).以质粒pSK-hSLC为模板进行PCR扩增，得到大小为420bp的hSLC基因片段，与预期的结果相一致。以XhoⅠ和EcoRⅠ酶切hSLC基因片段和载体pIRES后，进行连接，菌落PCR筛选及XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定证实pSLC-IRES构建成功。 (2).从人Jurkat细胞的总RNA中，用RT-PCR扩增的含信号肽的hIL-2基因片段大小为510bp，与预期的结果相一致。 (3).取hIL-2基因的PCR产物与pMD18-T载体进行连接，转化感受态DH5α菌株。菌落PCR扩增产物约为510bp。XbalⅠ酶切重组质粒后，得到250bp和2950bp大小的片段，表明目的基因片段已经插入pMD18-T中。提取质粒pMD-hIL-2进行测序，所测DNA的序列与GenBank中人IL-2cDNA的序列一致，表明扩增的为人IL-2基因。 (4).取pSLC-IRES质粒与经同样双酶切质粒pMD-hIL-2后获得的hIL-2基因片段相连接，转化感受态DH5α菌株。菌落PCR筛选及NotⅠ和SalⅠ双酶切鉴定证实，共表达质粒pIRES-hSLC-hIL-2构建成功。 (5).采用电穿孔法，以共表达质粒pSLC-IRES-IL-2转染COS-7细胞。Westernblot检测结果显示，转染后的COS-7细胞能分泌性表达SLC和IL-2蛋白。 2.小鼠SLC真核表达载体pVAX1-mSLC的构建及瞬时表达 (1).用BamHⅠ和XbaⅠ分别双酶切克隆质粒pMD-mSLC和pVAX1载体，回收410bp大小的mSLC片段及线性化pVAX1载体，进行连接，转化感受态TOP10菌株。菌落PCR筛选及HinDⅢ酶切鉴定证实，表达质粒pVAX1-mSLC构建成功。 (2).采用电穿孔法，以表达质粒pVAX1-mSLC转染COS-7细胞。Westernblot检测结果显示，转染后的COS-7细胞能表达mSLC。 结论 1.成功地构建hSLC和hIL-2基因的共表达质粒，以其转染COS-7细胞后，能分泌性表达SLC和IL-2，为探讨SLC和IL-2在抗肿瘤基因治疗中的协同效应提供实验依据。 2.成功地构建小鼠SLC基因的真核表达质粒pVAX1-mSLC，以其转染COS-7细胞后，能瞬时表达mSLC，为下一步进行肿瘤基因治疗的动物实验研究奠定了基础。