淡色库蚊是多种病毒病和寄生虫病的主要传播媒介，是室内叮吸骚扰人类的主要害虫，采用化学杀虫剂防治此类害虫具有相当长的历史，其优点是操作方便，迅速有效，因此在媒介昆虫防治中占有主导地位，曾为媒介昆虫和虫媒传染病的控制做出过巨大贡献。但由于蚊虫对环境高度的适应能力，频繁使用化学杀虫剂后，很容易产生抗药性，并且抗性程度增长快，抗性分布范围广，目前蚊虫对施用过的杀虫剂几乎都产生了不同程度的抗性，大大影响了它的杀虫效果。因此，及时掌握蚊虫抗药性的现状，研究其发生发展规律及治理对策是科学合理地进行化学防治的关键。多年来应用的WHO生物测定法检测抗性存在结果波动性大，重复性差，操作繁琐，需时长，在抗性水平低时难以测出抗性的存在等缺点。近年来，随着分子生物学技术的发展，对媒介昆虫抗性相关解毒酶的研究也不断深入，在基因水平检测蚊虫的抗药性成为抗性检测的重要研究方向。 媒介昆虫抗性相关解毒酶的基因扩增和突变是抗性的重要机理。其中，库蚊对有机磷杀虫剂产生抗性的主要机理是酯酶基因扩增导致解毒酶过度产生。库蚊抗性相关酯酶基因分为A组和B组，由两个紧密连锁的酯酶位点控制。抗性库蚊与敏感库蚊的酯酶没有质的差异。在酯酶基因中，仅少部分酯酶基因发生扩增，酯酶基因扩增为单独事件，非所有酯酶基因同时扩增，到目前为止，至少已发现十余种高活性酯酶，分别从A1到A9，从B1到B9，并且高活性酯酶的发生有一定的地理分布性。其中，A3和B3出现在美国的跗斑库蚊中(Cx.tarsalis)，其他种类酯酶出现在尖音库蚊复合组如淡色库蚊和致倦库蚊中。这些不同类型酯酶中A2/B2、A4/B4和A5/B5和A8/B8表现高度连锁不平衡，总是相伴出现在同一个体中。Raymond(1991)对比了酯酶B1、B2基因片段的碱基序列，发现两者有96％的同源性。用B1、B2基因的这两个同源片段作为探针，与扩增及非扩增的酯酶B基因均能杂交，而且这两个探针的杂交强度完全一致。王金福(1999)发现不同的有机磷杀虫剂对酯酶基因有明显的选择作用，双硫磷品系为B1型，毒死蜱和敌百虫品系为B2型，马拉硫磷品系为B1型和B1/B2杂合型。因此不同地区库蚊的酯酶基因扩增类型可能不同，同一地点库蚊的酯酶基因扩增类型也可能不同。如果分别从A组和B组酯酶基因中选取某一类型基因作为探针，同时检测各品系淡色库蚊，可以保证结果的全面性。该研究以我国北方重要的班氏丝虫病媒介淡色库蚊为研究对象，采用PCR法制备淡色库蚊酯酶B1、A2DNA探针，用于对淡色库蚊各抗药性品系的检测，同时以生物测定法检测结果为对照，以评价该探针用于蚊虫抗药性基因检测的效果。 完成的主要工作及实验结果： 1.淡色库蚊基因组DNA的提取：首先分别提取了大量淡色库蚊抗性品系和敏感品系基因组DNA，用于制备酯酶B1、A2目的片段，然后分别提取各品系和各个现场单蚊DNA。方法：用吸蚊管取羽化后24～48小时的成蚊，冷冻1小时后研磨成碎末，加匀浆缓冲液研磨后离心弃上清，37℃蛋白酶K消化3小时，酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇醋酸钠沉淀过夜，超纯水溶解，4℃保存。单蚊DNA提取方法同前。电泳条带清晰明亮，表明提取的基因组DNA较完整。 2.PCR扩增酯酶B1和A2目的片段：设计酯酶B1和A2引物，根据GeneBank分别从尖音库蚊酯酶B1基因和致倦库蚊A2基因的一段外显子各设计一对引物，由上海博亚生物公司合成，并在酯酶B1和A2上游引物5’端标记地高辛，进行PCR反应，低熔点凝胶经酚氯仿抽提法回收酯酶B1和A2探针，紫外分光光度计测算出探针浓度，-20℃保存。电泳条带十分清晰明亮，其中酯酶B1条带大小约450bp左右，酯酶A2条带大小约557bp左右，与预期扩增结果一致。 3.将淡色库蚊敌敌畏抗性品系与敏感品系基因组DNA热变性后点于尼龙膜上，固定，加入酯酶A2探针，固相杂交法杂交，洗膜，NBT-BCIP显色，摸索出一个合适的区分抗性与敏感品系的探针浓度。在此浓度下，抗性与敏感品系杂交点的阳性率有差别。取室内选育的各品系蚊虫杂交，显色，抗敌敌畏品系的杂交阳性率为43％，抗残杀威品系的杂交阳性率为25％，抗氯氰菊酯品系的杂交阳性率为21.7％，敏感品系的杂交阳性率为15％。然后，取现场蚊虫杂交，显色，唐口种群的杂交阳性率为33％，微山杂交阳性率为38％，滕州杂交阳性率为56％。 4.同理，摸索出一个合适的区分抗性与敏感品系的酯酶B1探针浓度。在此浓度下，抗性与敏感品系杂交点的阳性率有差别。取室内选育的各品系蚊虫杂交，显色，抗敌敌畏品系的杂交阳性率为40％，抗残杀威品系的杂交阳性率为23.3％，抗氯氰菊酯品系的杂交阳性率为18.3％，敏感品系的杂交阳性率为11.7％。然后，取现场蚊虫杂交，显色，唐口种群的杂交阳性率为31％，微山种群的杂交阳性率为34％，滕州种群的杂交阳性率为48％。 5.采用生物测定法测定室内各品系和现场蚊虫对DDVP的抗性，抗敌敌畏品系抗性指数为14.47，抗残杀威品系抗性指数为3.27，抗氯氰菊酯品系抗性指数为2.93，敏感品系抗性指数为1；唐口种群抗性指数为6.10，微山种群抗性指数为8.41，滕州种群抗性指数为21.18。 根据检测结果，该研究所制备的探针灵敏、可靠，地高辛杂交法检测与生物测定法检测结果有较高的一致性。该杂交方法检测抗性更简单、经济、方便，具有实用性，必将在蚊虫抗药性的分子生物学检测方面发挥重要作用。