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结核病是一种由结核杆菌感染引起的慢性传染病。八十年代中期以来，由于全球对结核病的忽视、艾滋病的流行、耐药结核病的出现以及流动人口的增加等原因，全球结核病再次出现流行高峰。据世界卫生组织估计，目前全球约有 20 亿结核杆菌感染者，活动性结核的病人达 2000 万，每年新发结核的病人达 1000 万 ,每年有 300 万人死于结核病，结核病已成为传染病的头号杀手。我国属于全球 22 个结核病高负担国家之一，病人数居全球第二。我国的结核病疫情具有高患病率、高耐药率、高死亡率、高感染率、低递减率及病人发现率低等“四高二低”的特点。广西的结核病疫情形势也很严峻，现有结核菌感染者 1500 万人，结核病患者 30 万余人，其中传染性肺结核患者 6万人，每年因结核病死亡者近万人。 耐多药结核病（MDR-TB）是指至少对抗结核药物中异烟肼（INH）和利福平(RFP)产生耐药的结核病，被WHO认定为全球结核病疫情回升的第三大因素。由于90％的结核杆菌RFP耐药株同时也对INH耐药，因此，RFP耐药被认为是多耐药的重要性标志。而近期的研究表明，RFP的耐药与结核杆菌rpoB基因的突变有关。因此，本课题以RFP为代表，进行结核杆菌耐药基因突变的检测方法研究，以寻找一种高效、快速、简便的RFP耐药性检测方法。 方法：1、首先根据药敏试验结果，对广西地区77株结核杆菌临床分离株的耐药情况进行分析，然后提取样本DNA，扩增rpoB基因，用DNA测序法检测77株临床分离株rpoB基因的突变情况，分析rpoB基因的突变与耐药的关系。2、利用基因芯片技术，对77株结核杆菌临床分离株及27份临床诊断为“肺结核”住院患者的晨痰标本，进行rpoB基因突变的检测，分析rpoB基因的突变类型，以及突变与耐药之间的关系。3、利用反向点杂交膜片技术，对63株结核杆菌临床分离株及27份临床诊断为“肺结核”住院患者的晨痰标本，进行rpoB基因突变的检测，分析rpoB基因的突变类型，以及突变与耐药之间的关系。 结果：1、77株临床分离株的药敏试验结果显示：对RFP耐药的62株临床分离株中，有61株同时对INH耐药，MDR-TB占98％（61/62）。DNA测序发现，91.9%（57/62）以上的RFP耐药株存在rpoB基因的RFP耐药决定区的突变，以531、526及516位点的突变为主，其中531位点的突变占59.6%（34/57），526位点的突变占19.3%（11/57），516位氨基酸的点突变占10.5%（6/57），两个位 2<WP=4>点的联合突变占5.3%（3/57），未检测到发生缺失或插入突变的菌株。2、用基因芯片对77株结核杆菌临床分离株的检测结果显示：62株药敏试验结果为RFP耐药的临床分离株中，57株芯片检测结果判定为RFP耐药株；15株药敏试验结果为RFP敏感的临床分离株中，12株芯片判定为敏感株。与传统药敏试验结果比较，基因芯片法检测的灵敏度为91.9％（57/62），特异度为80％（12/15）。对27份痰标本的检测结果为：13份药敏试验报告为RFP耐药的痰标本中，芯片检测结果有12份判定为RFP耐药；14份药敏试验报告为RFP敏感的痰标本，芯片检测判定其中的11例为RFP敏感型。与传统药敏试验结果比较，基因芯片检测痰标本的灵敏度为92.3%（12/13），特异度为78.6％（11/14）。3、利用反向点杂交膜片技术，对63株临床分离株进行检测：10株药敏试验结果为RFP敏感的临床分离株中，膜片未检测到突变；53株药敏试验结果为RFP耐药的临床分离株，其中的48株膜片检测到突变，判定为耐药株，另5株未检测到突变。与DNA测序结果比较，测序结果显示存在RFP耐药决定区突变的菌株，膜片均检测到突变，符合率为100%。与传统药敏试验结果比较，膜片检测临床分离株的灵敏度为90.6%（48/53），特异度为100%（10/10）。对27份痰标本的检测结果为：13份药敏结果为耐RFP的痰标本中，12份检测到RFP耐药决定区的突变，膜片检测判定为耐药；14份药敏结果为RFP敏感的痰标本，膜片未检测到突变。与传统药敏试验结果比较，膜片检测痰标本的灵敏度为92.3%（12/13），特异度为100％（14/14）。对10例临床分离株及10例痰标本的重复性试验结果显示，膜片检测的准确率平均为96.7%。 结论：1、广西地区 77 株结核杆菌临床分离株的耐药情况显示，98%的结核杆菌 RFP 耐药株同时也是 MDR－TB，RFP 耐药可作为多耐药结核杆菌的标志。2、RFP 耐药基因的突变情况与国内外的报道一致，以 531、526、516三个位点的突变为主，存在两个位点联合突变的现象，未发现其它新的突变位点。3、基因芯片可以满足检测 RFP 耐药基因的需要，一次可检测多个位点的突变，具有快速、灵敏、特异性高、信息量大的特点，是很有发展前景的检测手段。4、由于基因芯片制作成本较高，而且芯片的阅读需要借助昂贵的荧光扫描仪，因此它的普及与进一步推广受到较大的限制。5、反向点杂交膜片技术同样可以满足检测 RFP 耐药基因的需要，一次可检测多个位点的突变，具有快速、灵敏、特异性高、价格低廉、操作简便、重复性好等特点，可以替代基因芯片进行 RFP 耐药性的检测。6、反向点杂交膜片技术用生物?