【摘 要】
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目的:多种临床重大疾病均可致小肠粘膜遭受氧化应激损伤,导致肠道功能障碍、肠道细菌移位,甚至重症感染、多脏器功能衰竭,后果严重。而目前针对小肠的这种常见损伤,缺乏特效药物治疗,目前临床上仍以预防和对症处理为主,故寻找小肠氧化应激损伤保护性的药物已迫在眉睫。丹酚酸B（Sal-B）在各种不同细胞的抗氧化应激中保护机制的研究较多,但在小肠粘膜损伤保护机制方面的研究较少,尤其是在保护小肠粘膜细胞线粒体膜电位
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目的:多种临床重大疾病均可致小肠粘膜遭受氧化应激损伤,导致肠道功能障碍、肠道细菌移位,甚至重症感染、多脏器功能衰竭,后果严重。而目前针对小肠的这种常见损伤,缺乏特效药物治疗,目前临床上仍以预防和对症处理为主,故寻找小肠氧化应激损伤保护性的药物已迫在眉睫。丹酚酸B（Sal-B）在各种不同细胞的抗氧化应激中保护机制的研究较多,但在小肠粘膜损伤保护机制方面的研究较少,尤其是在保护小肠粘膜细胞线粒体膜电位、功能,及相关细胞通路方面研究,目前尚未见报道。本研究拟揭示丹酚酸B（Sal-B）活化Akt/GSK-3β信号通路保护小肠粘膜细胞线粒体功能,预防小肠粘膜氧化应激损伤的分子机制。将Sal-B与其他几种已知的具有抗氧化应激作用的天然药物对比,检验其抗氧化作用,并初步评价Sal-B的保护作用效果。方法:通过细胞培养方法,培养研究中使用的IEC-6肠粘膜细胞,通过MTT法对IEC-6肠粘膜细胞的存活及生长进行检验,并借此将Sal-B与乙酰半胱氨酸、红景天苷、原花青素、番茄红素这四种具有抗氧化作用药物进行药效的初步比较。通过活性氧（ROS）测定试剂盒对IEC-6肠粘膜细胞进行细胞活性氧检测。通过Transwell小室及相应试剂盒对IEC-6肠粘膜细胞跨膜电阻及渗透性进行检验。利用流式细胞仪检测IEC-6肠粘膜细胞凋亡,使用流式细胞仪及免疫荧光检测线粒体膜电位（ΔΨm）,以低膜电位细胞占全部细胞比例代表线粒体膜电位,利用单因素方差分析进行多组间的对比统计分析,P＜0.05表示差异有统计学意义。通过Western blot免疫印迹方法检测Akt及GSK-3β等蛋白及线粒体途径凋亡蛋白的表达,利用单因素方差分析进行多组间的对比统计分析。在动物实验中,构建大鼠小肠粘膜缺血再灌注损伤模型,将损伤组与Sal-B保护组做对比,通过免疫组化检测IEC-6肠粘膜细胞绒毛高度及隐窝深度,检测小肠粘膜的增殖（Brd U）及凋亡（cleaved caspase-3）指标,利用Western blot免疫印迹方法检测Akt及GSK-3β等蛋白的表达。在信号通路及Sal-B作用机制的验证上设计Rescue实验,利用LY294002对Akt/GSK-3β通路的抑制作用与TDZD-8对Akt/GSK-3β的活化作用对比,对该通路相关蛋白P-AKT及P-GSK-3β的表达进行半定量检测;对线粒体膜电位及功能相关蛋白Cyt-c、caspase-3、Bax、Bcl-2表达进行检测。所有结果组间比较,利用单因素方差分析进行多组间的统计分析,P＜0.05表示差异有统计学意义。结果:Sal-B的保护作用较乙酰半胱氨酸更明显（P＜0.05）。在天然药物中,Sal-B较红景天苷、原花青素、番茄红素保护作用更为显著（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05）。Sal-B减少H2O2诱导的细胞凋亡（P＜0.05）、线粒体膜电位去极化（P＜0.05）、ROS生成（P＜0.05）、恢复细胞的跨膜电阻值（P＜0.05）及细胞通透性（P＜0.05）,对氧化应激损伤的IEC-6细胞具有保护作用。LY294002下调Akt和GSK-3β的磷酸化水平,削弱Sal-B对IEC-6细胞（H2O2损伤）的保护作用（P＜0.05）;TDZD-8上调GSK-3β磷酸化水平,增强Sal-B对IEC-6细胞（H2O2损伤）的保护作用（P＜0.05）。氧化应激损伤IEC-6细胞时,Sal-B的处理活化Akt/GSK-3β信号转导,上调PI3K/Akt信号通路中的Akt（P＜0.05）和GSK-3β的磷酸化水平（P＜0.05）,继而通过恢复线粒体膜电位,保护线粒体功能（P＜0.05）,减少线粒体相关凋亡（P＜0.05）。动物实验显示Sal-B对缺血再灌注损伤的小肠粘膜具有明显保护作用,这种保护作用是通过活化Akt/GSK-3β信号通路来实现的。结论:1、Sal-B通过活化Akt/GSK-3β信号,继而恢复线粒体膜电位,保护线粒体功能,减少线粒体途径凋亡,保护小肠粘膜细胞,减轻其受到的氧化应激损伤。2、Sal-B可能是一种有效的保护肠粘膜、抗氧化应激损伤的天然单体药物,其机制与活化Akt/GSK-3β信号及保护线粒体功能有关。
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