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高等真核生物细胞信使RNA (mRNA)及一些病毒RNA的5’-端均具有N7或者2’-O甲基化修饰的帽子结构。同时,5’端的帽子修饰具有很多重要的生物学功能：保护信使RNA避免被5’外切酶降解；指导前体信使RNA的剪切及核输出；保证信使RNA的稳定性及有效的翻译。除此以外,2’-O帽子修饰已被证明可以帮助冠状病毒逃避胞内识别病毒双链RNA的受体MDA5(melanoma differentiation-associated gene5)的识别及干扰素诱导蛋白IFIT (IFN-induced proteins with tetratricopeptide repeats)介导的免疫抑制。由于病毒本身的加帽过程、机制与细胞内信使RNA的加帽存在很大差别,使病毒加帽酶作为抗病毒药物靶标成为可能。目前冠状病毒加帽酶抑制剂筛选平台的建立及冠状病毒甲基化修饰与免疫逃逸之间的关系成为研究的热点。本研究中,我们在酵母菌功能互补遗传系统之上构建了抑制酵母细胞生长的冠状病毒加帽抑制剂筛选平台。该平台以96、384微孔板作为筛选工具,通过吸光值法直接测定表达冠状病毒非结构蛋白14(Coronavirus nspl4)N7甲基转移酶(N7-methyltransferase, N7-MTase)酵母的生长状况,具备了高通量药物筛选的能力。利用此平台在5,000种天然化合物提取物中筛选到四种针对冠状病毒或者人类N7-MTase具有抑制效果的初级次生代谢产物。另外,我们利用以痘苗病毒为载体的反向遗传系统,构建了3’-5’外切酶(3’-5’Exonuclease)或者N7-MTase关键位点突变的重组鼠肝炎病毒。构建得到MHV-nsp14-D89A&E91A mutant, D330, C408R及Y414A四株重组突变鼠肝炎病毒。其中,MHV-D89A&E91A突变病毒株丧失外切酶活性但甲基转移功能不受影响；MHV-D330完全丧失N7甲基转移酶活性,并且在SARS复制子系统上证明该位点突变影响病毒的复制能力；MHV-C408R作为温度敏感突变株,在30℃条件下N7甲基化转移酶正常工作,37℃时M7-MTase及3’-5’Exonuclease活性均丧失；MHV-Y414A突变株N7甲基化功能丧失,在动物水平其复制能力及毒力均减弱。MHV-D89A&E91A外切酶活性突变病毒株其嗜斑大小比野生型病毒小,这与之前别人的报道一致；利用构建好的MHV-C408R温度敏感突变株作为阳性对照,发现MHV-Y414A N7甲基化功能突变株亦是温度敏感突变株,在39.5℃条件下没有出现病毒噬斑。总之,本研究为大规模筛选冠状病毒加帽酶抑制剂提供了良好的平台：384微孔板作为筛选工具,使得药物耗费量大大减少,节省了成本；仅仅利用分光光度法测定药物对酵母生长的抑制效果,实现了筛选的方便、快捷及直接性。另外,我们利用痘病毒为载体的反向遗传学系统,构建了四株重组鼠肝炎病毒,为验证冠状病毒nsp14的N端外切酶及C端甲基化酶,分别参与病毒RNA基因组复制保真性及免疫逃逸提供了非常宝贵的实验材料。