论文部分内容阅读
目的:研究在不同干预手段（电针、丰富康复训练、电针联合丰富康复训练）、不同治疗时程（3 d、7 d、14 d）下,对局灶性大脑中动脉缺血（middle cerebral artery occlusion,MCAO）大鼠脑皮质区缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）及其下游因子血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）表达的影响,探讨缺血侧神经结构和功能恢复与血管新生的关系,探究其脑保护作用的可能机制,为临床治疗缺血性脑卒中提供理论基础和借鉴。方法:1.购入SPF级雄性SD大鼠200只,按照随机数字表法进行编号,随机选取36只为假手术组,其余大鼠参照Longa等改良线栓法制备MCAO模型,将造模成功的大鼠144只,按随机数字表随机分为模型组、电针组、丰富康复组、电针联合丰富康复组（简称针康组）,每组36只。根据治疗时程的长短,将上述五组大鼠再分为3 d、7 d、14 d三个亚组,每个亚组12只。2.治疗组（电针组、丰富康复组、针康组）大鼠于造模麻醉清醒后（约术后4 h）进行干预治疗,1次/d,分别连续治疗3 d、7 d、14 d。电针组大鼠选取“百会”“水沟”穴和左侧“后三里”“曲池”穴进行电针刺激;丰富康复组大鼠置于丰富康复环境,并辅以康复训练;针康组大鼠先进行丰富康复训练,完成后休息10 min,电针“百会”“水沟”穴和左侧“后三里”“曲池”穴。假手术组与模型组大鼠常规饲养,只进行同等条件下抓取、固定,不进行任何干预治疗。3.分别于4 h、3 d、7 d、14 d运用改良神经功能缺损评分（modified neurological severity scores,m NSS）测定各亚组大鼠神经功能缺损体征;于5 min、3 d、7 d、14 d采用激光多普勒血流仪测定各亚组大鼠局部脑血流量（regional cerebral blood flow,r CBF）变化;苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）观察各亚组缺血侧大鼠脑皮质区病理学改变;免疫组织化学染色法测定各亚组大鼠缺血侧脑皮质区CD34+阳性细胞数,用Weidner法计算缺血侧脑皮质区微血管密度（microvessel density,MVD）,Western Blot、RT-q PCR检测各亚组大鼠缺血侧脑皮质区HIF-1α、VEGF、EPO蛋白和基因的表达情况。结果:1.改良神经功能缺损体征评分在术后四个不同时程（4 h、3 d、7 d、14 d）下,假手术组大鼠评分均为0分;模型组大鼠较假手术组术后四个同时程下评分均显著增高（P<0.01）,且随着治疗时程的延长,评分逐渐呈降低趋势;与模型组比较,电针组、丰富康复组在4 h、3 d时评分差异无统计学意义（P>0.05）,治疗7 d、14 d后评分均显著降低（P<0.01）,针康组治疗3 d、7 d、14 d后评分均低于模型组,差异具有极显著性（P<0.01）;与电针组、丰富康复组比较,针康组术后4 h、3 d差异无统计学意义（P>0.05）,在治疗7 d、14 d后,针康组评分显著低于电针组与丰富康复组,有显著性差异（P<0.05）;电针组与丰富康复组比较,在上述四个时程差异均无统计学意义（P>0.05）。2.缺血侧局部脑血流量假手术组大鼠术后四个时程（5 min、3 d、7 d、14 d）r CBF正常且平稳;模型组大鼠与假手术组相比,术后四个时程r CBF均显著降低（P<0.01）,并且随着治疗时程延长,r CBF逐渐呈上升趋势;与模型组比较,电针组、丰富康复组在5min、3 d时r CBF差异无显著性（P>0.05）,治疗7 d、14 d后r CBF均高于模型组,差异具有极显著性（P<0.01）,针康组在3 d、7 d、14 d三个时程r CBF均明显高于模型组（P<0.01）;与电针组、丰富康复组比较,针康组术后5 min r CBF差异无统计学意义（P>0.05）,在时程为3 d、7 d、14 d时,针康组r CBF均显著高于电针组、丰富康复组,有极显著性差异（P<0.01）;电针组与丰富康复组大鼠在上述四个相同时程（4 h、3 d、7 d、14 d）比较,r CBF差异均无统计学意义（P>0.05）。3.缺血侧皮质区脑组织病理学改变假手术组大鼠于术后3 d、7 d、14 d缺血侧皮质区神经细胞形态正常,结构完整,排列整齐且紧密,细胞周围间隙无水肿,无炎症细胞浸润现象。四组（模型组、电针组、丰富康复组、针康组）于术后3 d均表现为细胞结构疏松呈网状,排列紊乱稀疏,大量神经细胞固缩、变性坏死,间质水肿明显。毛细血管肿胀变形明显,胶质细胞增生,核仁深染等情况,且四组在光镜下脑病理学表现未见明显差异;较术后3 d比,四组（模型组、电针组、丰富康复组、针康组）于术后7 d均有所改善。与模型组相比,三组治疗组（电针组、丰富康复组、针康组）脑组织间质水肿、细胞结构、排列情况均明显减轻,修复较好,针康组改善最为显著;较术后3 d、7 d比,四组（模型组、电针组、丰富康复组、针康组）于术后14 d脑组织损伤程度显著减轻。与模型组比,治疗组的缺血皮质区内细胞结构较清晰,形状较规则,排列较有序,间质水肿减轻明显,其中针康组改善情况最为明显。4.缺血皮质区微血管密度假手术组大鼠在术后三个不同治疗时程（3 d、7 d、14 d）缺血侧皮质区MVD未有显著变化,均仅有少量表达;模型组大鼠术后三个时程较同时程假手术组大鼠缺血侧脑皮质区MVD均明显增高（P<0.01）;与模型组比较,电针组、丰富康复组、针康组治疗3 d、7 d、14 d后缺血侧皮质区MVD均增高,差异具有显著性（P<0.05或P<0.01）;与电针组、丰富康复组比较,针康组治疗3 d、7 d、14 d后MVD增高,有显著性差异（P<0.05）;电针组与丰富康复组比,上述三个时程差异均无统计学意义（P>0.05）。5.缺血皮质区HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表达假手术组在三个时程下（3 d、7 d、14 d）大鼠脑缺血皮质区HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表达未见明显改变;与假手术组比较,模型组大鼠术后三个时程缺血皮质区HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表达量均增高,差异具有极显著性（P<0.01）;与模型组比较,电针组、丰富康复组、针康组大鼠三个相同时程缺血皮质区HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表达量均显著增高（P<0.01）;与电针组、丰富康复组比较,针康组治疗3 d、7 d、14 d后HIF-1α、VEGF、EPO表达量明显增高（P<0.01）;电针组与丰富康复组比较,在3 d、7 d、14 d三个时程下HIF-1α、VEGF蛋白表达量差异均无统计学意义（P>0.05）,在3 d、14 d两个时程下,电针组与丰富康复组比较,EPO蛋白表达量未见明显差异,但在治疗时程为7 d时,丰富康复训练组EPO蛋白表达量明显高于电针组（P<0.01）。6.缺血皮质区HIF-1αmRNA、VEGFmRNA、EPOmRNA表达假手术组大鼠在术后三个时程（3 d、7 d、14 d）缺血皮质区HIF-1αmRNA、VEGFmRNA、EPOmRNA表达未见明显改变,仅有少量表达;模型组大鼠与假手术组比较,在术后三个相同时程缺血皮质区HIF-1αmRNA、VEGFmRNA、EPOmRNA表达量均增高,差异具有极显著性（P<0.01）;与模型组比较,电针组、丰富康复组、针康组大鼠在三个时程缺血皮质区HIF-1αmRNA、VEGFmRNA、EPOmRNA表达量均显著增高（P<0.01）;与电针组、丰富康复组比较,针康组治疗3 d、7 d、14 d后HIF-1αmRNA、VEGFmRNA、EPOmRNA表达量均增高,差异具有极显著性（P<0.01）;电针组与丰富康复组比较,在3 d、7 d、14 d三个时程下HIF-1αmRNA、VEGFmRNA、EPOmRNA表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。结论:1.电针、丰富康复训练、电针联合丰富康复训练均是有效的缺血性脑卒中治疗手段,能有效改善MCAO大鼠神经功能缺损体征,增加局部脑血流量,促进神经细胞结构的恢复,使新生毛细血管数目增多。与电针、丰富康复训练单一疗法比较,电针联合丰富康复训练疗法效果更为显著,且在14天内,治疗时程与治疗效果呈正相关。2.电针联合丰富康复训练对MCAO大鼠治疗作用的可能机制是早期介入进一步激活了HIF-1α蛋白和基因表达,进而激活了HIF-1α下游因子VEGF、EPO的表达,介导内皮细胞血管新生,发挥着脑保护作用。