一、基于数据挖掘对名中医司徒仪教授治疗内异症痛经用药规律研究:目的:本研究主要通过知识图谱分析、聚类分析、关联规则分析等方法挖掘司徒仪教授在治疗子宫内膜异位症痛经方面所积累的四诊资料,探索其常见证型与用药的关联以及常用药物与性味归经的规律,为了解司徒仪教授的用药特点与规律提供一定借鉴意义。方法:在全面采集司徒仪教授治疗内异症痛经的临床病历的基础上,充分运用数据统计与挖掘技术,进而处理临床收集的信息与数据,将深度访谈的定性研究方法与之结合,解释分析和统计结果。另外,以司徒仪教授本人的意见为主要参考对数据挖掘结果进行分析归纳,总结出既符合临床真实情况又反映司徒仪教授学术观点的经验。结果:(1)总体药物频次分析:共有中药数215味,中药功效大类19种,细分为41类,归经19类,四气8类。根据数据分析系统中组方分析“频次分析”得出,前25味中药分别为:白芍、桑寄生、枳壳、丹参、赤芍、三棱、莪术、茯苓、郁金、生地、香附、夏枯草、牡丹皮、延胡索、甘草、菟丝子、首乌、猫爪草、墨旱莲、穿破石、女贞子、益母草、白花蛇舌草、白术、青皮。主要归肝、脾、心、肾、胃、肺、胆、膀胱经。(2)药物功效分析:常用药物主要功效是补益肝肾、清热解毒、活血化瘀、疏肝行气、滋养肝肾、散寒止痛、健脾利湿等为法。(3)药物四气五味分析:药味方面,以甘(26.7%)、辛(26.4%)、苦(24.4%)味为主;药物以甘味益脾胃正气,辛味理气、活血、行血,苦味降气为主。药性方面,以温(26.3%)、平(21.9%)、微寒(21.2%)、寒(19%)、微温(9.5%)为主。(4)用药归经方面,从数据可得出,主要归肝经(23.5%)、肺经(13.4%)、胃经(13.4%)、脾经(12.8%)、肾经(12.8%)。(5)基于知识图谱分析法对证候要素分析:得出如下结论:肾虚血瘀证常用药物为:菟丝子、鹿角霜、桑寄生、莪术、三棱、水蛭、土鳖虫、延胡索、续断、三七、郁金、丹参。气虚血瘀证常用药物为:党参、白术、茯苓、白芍、枳壳、三棱、莪术、续断、丹参、牡蛎、甘草。湿热血瘀证常用药物为:白花蛇舌草、夏枯草、毛冬青、赤芍、茯苓、芦根、三棱、莪术、丹参、生地。脾虚湿瘀互结证常用药物为:山药、党参、茯苓、白术、生地、白花蛇舌草、白茅根、白芷、赤芍、牡丹皮、仙鹤草、续断、三棱、莪术。血瘀证常用药物为:续断、延胡索、莪术、三棱、水蛭、土鳖虫、牡蛎、郁金、赤芍、茯苓。肝气郁结证常用药物为:柴胡、黄芩、白芍、青皮、川楝子、延胡索、枳壳、丹参、郁金、猫爪草、牡蛎、玄参。脾肾两虚证常用药物为:党参、山药、黄芪、茯苓、熟地、白芍、杜仲、菟丝子、枸杞子、山茱萸。肝肾不足证常用药物为:白芍、生地、黄精、沙苑子、百合、补骨脂、丹参、浮小麦、郁金、赤芍、女贞子、墨旱莲、桑寄生、菟丝子、茺蔚子。肾气不足证常用药物为:熟地、山茱萸、山药、鹿角霜、桑寄生、生地、茯苓、墨旱莲、女贞子、菟丝子、续断。(6)基于知识图谱分析的组方与药对关联规则分析:聚类1:常用药对如下:鱼腥草——蒲公英;猪苓——泽泻;薏苡仁——败酱草——车前草——白花蛇舌草——毛冬青。聚类2:小茴香——吴茱萸;蒲黄——血余炭——茜草;延胡索——五灵脂——木香——乌药——川楝子。聚类3:淫羊藿——补骨脂——肉苁蓉;黄精——枸杞子——山茱萸;柏子仁——酸枣仁。聚类4:常用药对如下:三棱——莪术;威灵仙——穿破石;夏枯草——猫爪草。聚类5:石斛——百合;北沙参——葳蕤。聚类6:红花——泽兰——丹参;桃仁——苏木。聚类7:荆芥炭——侧柏叶——地榆——海螵蛸;仙鹤草——重楼——墨旱莲。聚类8:桑叶——枇杷叶;紫苑——款冬花;前胡——桔梗。聚类9:荔枝壳——海藻;藕节——槐花——紫珠——贯众;茵陈——土茯苓;龙骨——糯稻根——浮小麦;山楂——昆布;远志——石菖蒲;乳香——三七;僵蚕——地龙;大黄——枳实;豨莶草——海风藤。结论:本次研究纳入的有效病案资料反映出,以子宫内膜异位症痛经临床证候要素作为最主要的症状组群,可初步作为中医临床诊断该疾病的临床路径的参考。子宫内膜异位症的证候总体不离血瘀,但多为虚实夹杂之证,临床应根据具体情况辨证施治。本次数据挖掘对司徒仪教授治疗内异症痛经用药规律进行研究,其结果较为准确地反映了司徒仪教授对本病的基本病机和证候要素的认识,同时初步反映其用药思路与用药特色。二、实验研究:目的:选用司徒仪主任经典方——莪棱胶囊,作用于子宫内膜异位症模型大鼠,观察化瘀消癥中药对EMs的确切作用机理及作用靶点。从血管生成的分子机制进行EMs的治疗干预,以TLR4/NF-κB信号通路为切入点,探讨化瘀消癥中药抑制EMs血管生成的分子机制,为发现EMs的潜在药物靶点进行有益的探索,进而为名中医司徒仪教授的学术传承与创新起到一定作用。方法:选用SPF级健康成熟未交配的雌性SD大鼠,用自体移植法构建EMs大鼠模型,4周后观察建模情况,证实造模成功后,随机区组分组法分为模型对照组,中药高、中、低剂量组,每组12只,同批购置饲养的SPF级健康成熟未交配的雌性SD大鼠12只为空白对照组。给药:中药高、中、低剂量组混悬液灌胃,剂量分别为:2g/kg,1g/kg,0.5g/kg,每日1次。模型对照组:每日灌服生理盐水,剂量为:10ml/kg,每日1次。空白对照组:不造模,常规饲养。给药4周后,禁食12小时,经10%水合氯醛麻醉,腹主动脉采血,观察各组造模大鼠移植物生长情况,并测量其体积大小,分别取其在位内膜和异位的内膜。观察观察子宫内膜组织学变化特点;透射电镜观察在位/异位子宫内膜的超微结构;ELISA法检测大鼠血清VEGF、PDGF、FGF含量;免疫组化法检测异位内膜病灶蛋白表达变化;Real-Time PCR检测在位及异位子宫内膜VEGF、TLR4、NF-κBmRNA表达。结果:通过异位子宫内膜组织外观观察和组织病理检查相结合的方法来评价大鼠子宫内膜异位症模型。造模结果显示:移植的子宫内膜生长发育良好,呈现为颜色红润的囊性组织,质地柔软的半椭圆形,隆起于腹壁内侧,组织血管形成良好,与周围组织存在良好的血管联系。通过肉眼大体观察,血管化的内异症病灶在模型大鼠成功形成。(2)移植内膜与大鼠盆、腹腔组织粘附较为牢固,隆起明显,质地变硬,粘附区域的血管网发育良好,且与周围组织粘连,不易剥离。与模型组比较,药物高、中、低剂量组移植物体积显著小于模型组(P<0.05),说明经给药处理后各组大鼠的异位子宫内膜移植组织受到明显抑制。(3)HE染色可见:正常组的子宫内膜上皮结构连续完整,间质细胞丰富排列紧密,腺体结构清晰未见萎缩。模型组可见典型异位内膜组织,内膜上皮增生呈柱状或增生呈假复层结构,间质细胞数量增多血液供应丰富,组织增生明显,腺体数量增多。高剂量组可见上皮细胞、间质细胞增生变厚,供血较丰富,但腺体部分变性萎缩。莪棱胶囊中、低剂量组可见内膜上皮细胞呈柱状增生,间质细胞数量明显减少,腺体内大量空泡细胞及腺体萎缩,供血较差。(4)子宫内膜超微结构观察:正常对照组子宫内膜上皮细胞排列紧密,呈柱状增生,近腔面可见细胞之间存在紧密连接,细胞腔面微绒毛密集;腺上皮细胞界线清晰,形态大小正常;细胞核形态较规则,类椭圆形,极少有凹凸边迹,核膜界线清楚;胞浆内富含有线粒体,呈圆形或杆状,板状峭,发育良好,呈平行排列;粗面内质网和溶酶体较少;核位于基底部,类椭圆形,核膜光滑,异染色质分布均匀。模型对照组子宫内膜上皮细胞排列较为紧密,细胞之间的连接复合体发育较差;腺腔较为狭窄,微绒毛大部分出现脱落;细胞界线基本清晰可见,胞浆内含较多肿胀线粒体,多数肿胀为圆形,峭多消失,基质空亮;粗面内质网和溶酶体较少可见,出现肿胀空泡化;核膜界线清晰可见,局部可见多个凹陷性深切迹,少量的异染色质集聚靠近核膜,排列紧密。(5)各组大鼠血清中VEGF、b FGF、PDGF含量:比较大鼠血清VEGF、b FGF、PDGF ELISA结果提示,与正常组相比,模型对照组VEGF含量有显著性升高(p<0.01),b FGF和PDGF含量无显著性差异(p>0.05);与模型对照组相比,莪棱胶囊高、中、低剂量能显著降低VEGF、b FGF、PDGF含量(P<0.01,P<0.05),提示莪棱胶囊能够显著抑制子宫内膜异位症大鼠血清VEGF、b FGF、PDGF的含量。(6)免疫组化法检测相关血管生成因子表达变化:异位内膜VEGF、b FGF、PDGF的表达方面,造模成功后,各组异位内膜均可见丰富的间质细胞,类似于典型子宫内膜间质。部分间质细胞可呈现明显的梭形和成纤维样改变。用药后,部分腺体呈现蜕膜样改变,胞质空泡和间质粘液样变。异位内膜间质细胞浸润表现较常见,典型的异位内膜腺体少见,可见病灶血管增生(即微血管形成)。模型及中药高、中、低剂量组的在位及异位内膜均有VEGF、b FGF、PDGF、NF-κB、TLR4的表达,其表达的部位和强弱具有差异。VEGF在内膜中的表达部位主要定位于腺上皮细胞的细胞浆及细胞膜中,呈棕黄色弥漫性分布;b FGF主要表达于腺上皮细胞的细胞浆及细胞核膜;PDGF主要表达于子宫内膜腺上皮细胞的胞浆中,间质细胞微弱表达。与空白对照组相比,模型组VEGF、b FGF、PDGF蛋白表达明显升高(p<0.01),与模型对照组相比,经莪棱胶囊治疗后,各组指标表达降低,具有显著统计学意义(p<0.01)。(7)异位内膜TLR4、NF-κB蛋白表达方面,免疫组化染色结果显示,NF-κB在内膜中表达部位主要定位于腺上皮细胞的细胞浆及细胞膜中;TLR4主要表达于腺上皮细胞的细胞浆,间质细胞表达弱于腺上皮细胞。与空白对照组相比,模型组在位与异位内膜TLR4、NF-ΚB蛋白表达明显升高(p<0.01),与模型对照组相比,经莪棱胶囊治疗后,各组指标表达降低,具有显著统计学意义(p<0.01)。提示莪棱胶囊能够显著抑制子宫内膜异位症TLR4、NF-κB的表达。(8)各组大鼠在位及异位内膜组织NF-κB、TLR4 mRNA结果分析,与正常组对比,NF-κB、TLR4 mRNA在模型大鼠及莪棱胶囊药物高、中、低剂量组的在位及异位内膜的mRNA表达均有相对表达升高,差异具有统计学意义(P<0.01),NF-κB mRNA在异位内膜中的表达高于在位内膜,而TLR4 mRNA在在位内膜中的表达高于异位内膜。与模型组比较,莪棱胶囊高、中、低剂量组表达均有降低,差异具有显著统计学意义(P<0.01),说明莪棱胶囊可降低在位及异位内膜中NF-κB、TLR4 mRNA的表达。结论:(1)EMs模型大鼠异位内膜体积明显增大,血清相关血管生成因子表达增加,证实异位内膜的生长需要大量新的血液供应。莪棱胶囊通过缩小异位移植物的体积、抑制新生血管形成,有效抑制模型大鼠子宫内膜异位症的发生、发展。(2)模型大鼠在位内膜和异位内膜蛋白表达水平的检测结果,莪棱胶囊可能降低模型大鼠及局部的表达水平,阻止或延缓了疾病的发生和发展。(3)“黏附、侵袭、血管生成的过程”与EMs病程的发生发展密切相关,结合前期的研究结果,莪棱胶囊可能通过调节“3A”机制中的相关因子的表达,抑制异位内膜的黏附、侵袭和局部新生血管的形成,降低异位内膜组织种植、侵袭、转移能力,最终抑制EMs的形成和发展。