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腺病毒可引起严重呼吸道疾病,其中E组的4型、B组的7型最为常见,是免疫力低下人群暴发急性呼吸道疾病的首要病原体。世界范围内仅有美国报道使用了人腺病毒4型和7型肠溶型腺病毒口服活疫苗,临床研究表明其具有良好的安全性和有效性。源自当年流行株RI-67的美国4型腺病毒疫苗株最重要的错配发生在ITR区。本研究为获得与美国4型腺病毒疫苗株ITR序列一致的病毒株,首先对人4型腺病毒株RI-67 ITR区进行突变,通过Red同源重组技术获得ITR突变的人4型腺病毒全基因组感染性克隆pBR-Ad4-ITRmut。酶切释放病毒基因组转染293T细胞获得复制速率减慢的仿美国4型腺病毒疫苗株HAd4-ITRmut。人4型腺病毒疫苗株可以通过基因工程手段改造获得,但7型腺病毒疫苗株由于与流行株的基因序列差异较大,故不容易通过人工改造方法获得,因此研究设计一种4/7型双价腺病毒疫苗,不仅可以补充我国腺病毒疫苗的缺乏,而且减少生产线,降低生产成本,还能简化服用方法。为此本研究构建了 4/7型双价腺病毒候选减毒活疫苗株。人7型腺病毒六邻体高可变区的E3表位是其重要病毒抗原中和表位,将7型腺病毒E3表位替换到4型腺病毒相应位置以构建4/7型双价腺病毒候选活疫苗株。通过Red重组系统和正反向筛选系统,首先将质粒pBR-Ad4-ITRmut相应六邻体E3中和表位插入KanSacB序列,形成中间质粒pBR-Ad4-Ad7E3-KanSacB,以包含HAdv-7 E3中和表位的短核苷酸序列进行双链置换,通过反向筛选得到含有不同组别抗原表位的重组质粒pBR-Ad4-Ad7E3,释放嵌合基因组转染293T细胞得到双价重组腺病毒候选减毒活疫苗株Ad4ITRmut-Ad7E3。对所构建的中和表位嵌合型双价重组腺病毒候选疫苗株Ad4ITRmut-Ad7E3开展免疫学特性研究。以腹腔注射方式免疫BALB/c小鼠,三次免疫后产生的抗体能中和约76%的HAdv-7,能中和高达100%的HAdv-4腺病毒;以口服灌胃方式免疫BALB/c小鼠,冲击免疫后产生的抗体能中和约35%的HAdv-7腺病毒,能中和高达60%的HAdv-4腺病毒。实验结果表明了该疫苗株能有效激发动物体内免疫应答,不仅产生针对人4型腺病毒的抗体,嵌合的人7型腺病毒E3中和表位还能产生针对人7型腺病毒的抗体。冲击免疫两周后对腹腔注射组小鼠分别进行HAdv-4及HAdv-7腺病毒攻毒试验,结果表明Ad4ITRmut-Ad7E3对BALB/c小鼠有一定的保护作用,初步评价了双价重组腺病毒候选疫苗株Ad4ITRmut-Ad7E3作为人用腺病毒口服疫苗的可能性。目前尚无不同组别双价腺病毒疫苗株研究的报道,本课题所构建的Ad4ITRmut-Ad7E3是拥有自主研发产权的双价腺病毒候选减毒活疫苗株,是我国用于预防由腺病毒引起呼吸道感染的重要补充。