目的:1.检测结肠癌实体组织中干细胞相关分子标记CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4及Bmi-1与癌旁组织的表达差异。结肠癌细胞株SW620用CD133免疫磁珠分选后CD133+细胞与CD133-细胞中上述基因的表达差异。2. pSIREN-bmi-1-2转染结肠癌细胞株SW620细胞,检测转染前后目的基因Bmi-1在mRNA和蛋白水平的表达差异。3.检测结肠癌与癌旁组织miR-24-1和miR-106a的表达差异,及它们的表达与C-myc的表达是否具有关联性,并探讨它们在结肠癌中的作用机理。方法:1.选临床病理诊断明确的结肠癌患者,手术后取癌组织标本提取RNA,RT-PCR检测CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1在结肠癌组织与癌旁组织中的表达。2.流式细胞技术检测结肠癌细胞株SW620、SW480、Lovo细胞CD133单克隆抗体的表达,选出最高表达的细胞株用于磁珠分选。3. CD133免疫磁珠分选SW620,提取CD133+细胞与CD133-细胞的总RNA,RT-PCR检测分选后CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1的表达差异。4.采用脂质体介导转染法,将重组逆转录病毒载体pSIREN-bmi-1-2(实验室保存)转染结肠癌细胞SW620,用嘌呤霉素筛选稳定转染的单克隆细胞,扩大培养。5.荧光定量PCR检测转染载体前后Bmi-1基因在mRNA水平的表达情况。6. Western Blot检测载体转染前后SW620细胞Bmi-1蛋白表达的变化。7. TaqMan MicroRNA assays检测结肠癌组织与癌旁组织miR-24-1和miR-106a的表达差异。结果:1. 29例标本均诊断为低、中分化腺癌或粘液腺癌,干细胞相关分子标记癌组织与癌旁组织表达灰度相对值分别为CD133(189.1±25.4,49.4±9.6)、CD166(120.3±21.4,47.0±9.7)、Oct4(152.3±18.2,80.6±12.7)、Sox2(43.2±8.2,18.0±3.2)、C-myc(234.6±31.0,104.7±17.8)、Klf4(189.8±26.1,85.8±13.8)以及Bmi-1(266.5±23.3,157.8±19.0),癌组织表达均高于癌旁组织(P<0.05)。2.流式细胞术检测SW620表达CD133为15.1%、SW480为8.5%、Lovo为6.8%,选SW620细胞进行磁珠分选。3.流式细胞术检测免疫磁珠分选后SW620细胞中CD133+细胞纯度88.5%,CD133-细胞纯度为99.9%;RT-PCR检测分选后CD133+细胞CD133,CD166,Oct4, Sox2,C-myc,Klf4,Bmi-1表达,结果均高于CD133-细胞。4.嘌呤霉素筛选稳定转染的单克隆结肠癌细胞的最佳剂量为0.8ug/ml。5.荧光定量PCR检测Bmi-1 mRNA水平的表达情况,结果显示pSIREN-bmi-1-2组Bmi-1 mRNA水平与空白对照组相比,表达水平有所降低,Bmi-1 mRNA表达抑制率为68%,差异有统计学意义(P<0.05)。6. Western Blot检测Bmi-1蛋白水平的表达研究显示: Bmi-1在pSIREN-bmi-1-2组的蛋白表达低于空白组的表达,Bmi-1蛋白表达受抑制。7.结肠癌组织与癌旁组织miR-24-1的表达无差异;C-myc表达阳性的癌组织表达miR-106a要明显高于癌旁组织,其差别具有显著统计学意义(P<0.01);C-myc表达阴性的癌组织表达miR-106a也高于癌旁组织(P<0.01)。结论:1.结肠癌实体组织干细胞相关分子标记CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4及原癌基因Bmi-1的表达均高于癌旁组织。2.在大肠癌细胞株SW480、SW620和Lovo三系细胞中,SW620表达CD133表面抗原最高,所以选SW620细胞用于磁珠分选。3.分选后SW620细胞株CD133+细胞干细胞相关分子标记CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4及Bmi-1的表达高于CD133-细胞,说明CD133,CD166, Oct4,Sox2,C-myc,Klf4,Bmi-1相关干细胞标记可作为结肠癌肿瘤干细胞标记并有望用于诊断和预后检测。4.重组载体pSIREN-bmi-1-2抑制了Bmi-1基因在SW620细胞中mRNA和蛋白水平的表达。5.结肠癌组织C-myc阳性组和C-myc阴性组表达miR-106a均高于癌旁组织,miR-106a有可能作为结肠癌的筛查目标之一;结肠癌组织C-myc阳性组和C-myc阴性组表达miR-24-1与癌旁组织无差异,miR-24-1与结肠癌的关系还需更多研究证明。