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目的:研究凋亡抑制因子Livin特异的短发夹状RNA(shRNA)在MCF7乳腺癌细胞中对外源livin基因表达的抑制作用。
方法:利用基因重组技术构建四组EGFP-Livin融合表达的重组质粒:Pgenesil-8-livin-shRNA1,Pgenesil-8-livin-shRNA2,Pgenesil-8-livin-HK,Pgenesil-8-livin(Pgenesil-8为含有绿色荧光蛋白EGFP的空质粒产品,shRNAl,shRNA2为目的基因livin α的两个干扰片断,HK为通用阴性对照序列,livin表示GenBank中livin α的cDNA序列中的CDS区,GI:15680240,)电转染入MCF7乳腺癌细胞中,24h后荧光显微镜观察转染情况,48h后用荧光显微镜观察各实验组细胞中EGFP的表达,流式细胞仪检测细胞转染后平均荧光强度,即标志livin α在蛋白水平上的表达。应用半定量逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各实验组细胞中livin α在RNA水平的表达。
结果:转染24h后,荧光显微镜观察结果显示载体成功转染入MCF7乳腺癌细胞,四组细胞的转染效率40%-70%不等。转染入Pgenesil-8-livin-shRNA1, Pgenesil-8-livin-shRNA2的两组MCF7乳腺癌细胞中绿色荧光亮度都弱于转染了 Pgenesil-8-livin-HK ,Pgenesil-8-livin 的两组细胞中 EGFP 的亮度, Pgenesil-8-livin-shRNA2转染后的细胞中目的基因mRNA的表达量与Pgenesil-8-livin转染后的细胞中mRNA的表达量相比差异显著(P<0.01),有统计学意义。而Pgenesil-8-livin-shRNA1转染后的细胞中目的基因mRNA的表达量与Pgenesil-8-livin转染后的细胞相比无显著差异(P>0.05),无统计学意义。
结论:目的基因的干扰序列shRNA2对目的基因livin α在MCF7乳腺癌细胞中有干扰效果,抑制了livin α基因的表达。而shRNA1对目的基因livin α无干扰作用,且不能抑制目的基因的表达,为无效序列;shRNA2干扰序列可以干扰MCF7乳腺癌细胞外源livin α的表达,为下一步细胞内源基因的干扰以及动物体内实验打下了基础。