【摘 要】
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目的:构建Lnc RNA TUG1低表达人正常食管上皮细胞（HEEC）稳定株,探讨长链非编码RNA（Lnc RNA）在幽门螺杆菌协同MNNG在食管上皮细胞恶性转化中的作用,为防治食管癌提供理论依据。方法:利用以慢病毒为载体的RNAi技术,构建Lnc RNA TUG1低表达人食管上皮细胞稳定株。实验分组为Lnc RNA TUG1低表达组（Lnc RNA TUG1-KD组）、Lnc RNA TUG1空
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目的:构建Lnc RNA TUG1低表达人正常食管上皮细胞（HEEC）稳定株,探讨长链非编码RNA（Lnc RNA）在幽门螺杆菌协同MNNG在食管上皮细胞恶性转化中的作用,为防治食管癌提供理论依据。方法:利用以慢病毒为载体的RNAi技术,构建Lnc RNA TUG1低表达人食管上皮细胞稳定株。实验分组为Lnc RNA TUG1低表达组（Lnc RNA TUG1-KD组）、Lnc RNA TUG1空载体组（Lnc RNA TUG1-NC组）和对照组（人食管上皮细胞）。CCK8法测得MNNG的IC50值。幽门螺杆菌以MOI=100:1（细菌:细胞=100:1）协同MNNG染毒致细胞发生恶性转化。通过细胞形态学观察、细胞增殖实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验观察各组细胞在染毒后不同时期指标的变化;采用彗星实验观察各组细胞在染毒后不同时期DNA损伤情况;采用RT-RCR、Western Bolt和ELISA技术检测不同染毒时间细胞PAK1基因和蛋白表达水平以及IL-8、GRO-α含量;以软琼脂生长出细胞克隆团界定细胞的恶性转化。结果:（1）成功构建Lnc RNA TUG1低表达人食管上皮细胞稳定株,且经实时荧光定量PCR检测,Lnc RNA TUG1敲减效率达51.1%,t=11.98,P＜0.001。（2）细胞形态学发现在染毒早、中期各组细胞形态变化较小,染毒至晚期,Lnc RNA TUG1-KD组细胞少数出现细胞拉长现象,而Lnc RNA TUG1-NC组细胞形态变化较大,细胞拉伸变长,排列不规则等。（3）细胞增殖实验发现,各组细胞在早期和中期,Lnc RNA TUG1-KD组与Lnc RNA TUG1-NC组细胞增殖速度小于对照组（均有P＜0.001）。染毒晚期各组细胞增殖有差异（F=6.873,P=0.028）,且Lnc RNA TUG1-NC组细胞增殖速度高于Lnc RNA TUG1-KD（P＜0.001）。（4）细胞周期实验发现,在不同染毒时期的Lnc RNA TUG1-KD组与Lnc RNA TUG1-NC组均出现G0/G1期减小的现象（均有P＜0.05）。（5）细胞凋亡实验发现,在不同时期的Lnc RNA TUG1-KD组与Lnc RNA TUG1-NC组细胞总凋亡率均高于对照组（均有P＜0.05）。（6）彗星实验发现,且经过Olive尾矩分析后发现相较于对照组Lnc RNA TUG1-KD组与Lnc RNA TUG1-NC组均出现DNA损伤,且Lnc RNA TUG1-NC组DNA损伤情况更严重（P＜0.001）。（7）PAK1在染毒后不同时期出现Lnc RNA TUG1-NC组蛋白表达高于Lnc RNA TUG1-KD组（均有P＜0.001）,且在基因检测水平发现相同趋势;其下游因子IL-8和GRO-α含量均比对照组显著增加,且Lnc RNA TUG1-KD组IL-8和GRO-α含量均小于Lnc RNA TUG1-NC（均有P＜0.001）。（8）细胞染毒至35代,Lnc RNA TUG1-NC组细胞出现明显克隆,且克隆形成率高于Lnc RNA TUG1-KD组（P＜0.001）。结论:（1）人食管上皮细胞中低表达的Lnc RNA TUG1在幽门螺杆菌协同MNNG染毒过程中能抑制细胞增殖、扰乱细胞周期分布并降低细胞凋亡。（2）幽门螺杆菌协同MNNG染毒中,降低Lnc RNA TUG1的表达能使细胞Olive尾矩减小并减轻细胞DNA损伤。（3）人食管上皮细胞中低表达的Lnc RNA TUG1能降低PAK1的表达从而减小下游炎症因子IL-8、GRO-α的产生;（4）低表达的Lnc RNA TUG1人食管上皮细胞软琼脂克隆形成率减少,细胞恶性程度降低。
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