论文部分内容阅读
1.背景与目的去氢骆驼蓬碱（Harmine,HAR）是一个β-咔啉类生物碱,广泛分布于自然界的动植物中。课题组前期研究发现,HAR具有抑制乙酰胆碱酯酶等生物活性,也具有改善学习记忆障碍等药理作用,有望开发为治疗阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）等的新型药物。但是,高剂量的HAR会引起类帕金森病（Parkinson’s disease,PD）症状的中枢性震颤毒性,限制了HAR的新药研发和临床用药。美金刚胺（Memantine,MEM）是一个温和的非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂。研究发现,MEM既可以减弱兴奋毒性,缓解中枢性震颤PD症状,也可以改善AD的症状。综上所述,本课题拟采用中药药理学、分析化学、分子生物学和药代动力学等多种学科的理论和研究方法,从药效学和药动学两个方面对HAR联合MEM对记忆损伤模型的影响、MEM对HAR引起震颤的影响和HAR与MEM的药代动力学药物的相互作用进行研究。明确HAR和MEM的药效学和药动学相互作用,为将HAR开发为新型治疗AD的有效药物、HAR的临床用药和药物相互作用提供重要的研究思路和理论基础。2.方法（1）去氢骆驼蓬碱联合美金刚胺的药效和毒性药物相互作用研究:首先是HAR联合MEM对记忆损伤模型的影响。雄性C57BL/6小鼠随机分为十组,分别为对照组（Control组）、模型组（Scopolamine组）、HAR-L组（5 mg/kg HAR）、HAR-M组（10 mg/kg HAR）、HAR-H组（20 mg/kg HAR）、HAR-L联合MEM组（5 mg/kg HAR和4 mg/kg MEM）、HAR-M联合MEM组（10 mg/kg HAR和4 mg/kg MEM）、HAR-H联合MEM组（20 mg/kg HAR和4mg/kg MEM）、阳性药组（Donepezil组,5 mg/kg）和MEM组（4 mg/kg MEM）。其中对照组和模型组给予生理盐水。各个组在连续给予相应药物7天后,除对照组给予生理盐水,其余九组在第8天开始每天在给药30min后腹腔注射东莨菪碱1 mg/kg,继续给药7天,第15天进行水迷宫空间搜索实验,次日腹腔注射东莨菪碱30min后,取海马和皮层脑组织。利用Morris水迷宫行为学测定仪,考察HAR和HAR联合MEM对记忆损伤模型的改善作用。随后,通过分析化学、分子生物学和药理学等技术从相关神经递质、蛋白表达和神经元染色等方面,探究HAR和MEM的相互作用在改善学习记忆上的表现。其次是MEM对HAR引起震颤的影响。SD雄性大鼠随机分为五组,分别是对照组（Control组,给予生理盐水）、HAR组（10 mg/kg HAR）、MEM-L联合HAR组（2 mg/kg MEM和10 mg/kg HAR）、MEM-M联合HAR组（4 mg/kg MEM和10 mg/kg HAR）、MEM-H联合HAR组（8 mg/kg MEM和10 mg/kg HAR）。先腹腔注射给予大鼠相应剂量的MEM,10min后再给予10 mg/kg HAR,对照组先后均给予等量的生理盐水,立即进行后续实验。运用震颤检测仪对震颤行为学进行评价,随后通过分析化学方法,利用超高效液相-质谱联用技术测定相关神经递质,初步探究HAR诱导中枢性震颤的机制以及HAR和MEM在神经递质水平相互作用的影响,再对神经元进行染色,观察其状态。（2）去氢骆驼蓬碱与美金刚胺的药动学药物相互作用研究:首先利用Agilent1290-Agilent 6410三重四极杆质谱仪,建立同时检测MEM、HAR和哈尔醇（Harmol,HOL,HAR的主要代谢产物）的生物样品分析方法,并对选择性、残留效应、标准曲线、检测下限（Lower limit of detection,LLOD）、定量下限（Lower limit of quantitation,LLOQ）、精密度、基质效应、回收率和稳定性进行生物样品分析方法的方法学考察。然后对HAR与MEM在大鼠体内的药动学药物相互作用进行探究。SD雄性大鼠随机分为七组,一组给予大鼠灌胃溶于超纯水的MEM（5 mg/kg）,即为MEM组;三组分别给大鼠灌胃低（20 mg/kg）、中（40 mg/kg）、高（80 mg/kg）三个剂量的HAR;另外三组分别给予低（20 mg/kg）、中（40 mg/kg）、高（80 mg/kg）三个剂量HAR联合5 mg/kg的MEM。在给药后0（给药前）、0.08、0.17、0.25、0.33、0.5、0.75、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0和24.0 h从眼眶静脉丛采血0.25 m L左右,用UPLC-MS/MS方法对血浆中MEM、HAR和HOL进行定量分析。3.结果（1）去氢骆驼蓬碱联合美金刚胺的药效和毒性药物相互作用研究:HAR联合MEM对记忆损伤模型的影响中,Morris水迷宫行为学实验显示,单独给予三个剂量HAR（5、10、20 mg/kg）或三个剂量HAR联合MEM（4 mg/kg）均能缩短小鼠的游泳路程和上台潜伏期（P<0.05,P<0.01或P<0.001）,增大穿台次数（P<0.05,P<0.01或P<0.001）,且联合给药组对其影响大于单独给予HAR组。海马皮层内神经递质检测和蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）实验结果显示,高剂量的HAR和三个剂量HAR联合给药组海马皮层中ACh/Ch显著升高（P<0.01和P<0.001）,HAR-H组和三个剂量HAR联合给药组海马皮层中ACh E的蛋白表达显著降低（P<0.05,P<0.01或P<0.001）,并且海马中中高剂量HAR组和中高剂量HAR联合MEM组中Ch AT的蛋白表达有所升高（P<0.05,P<0.01）。单独给药和联合给药均能使海马皮层中Glu的含量减少（P<0.001）,GABA的含量增加（P<0.01和P<0.001）,Glu/GABA显著降低（P<0.001）,且联合给药组比单独给予HAR变化更为显著（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。另外,中高剂量HAR组和中高剂量HAR联合MEM组,海马皮层中5-HT/5-HIAA极显著增加（P<0.001）。神经元染色结果显示,HAR和HAR联合MEM均能改善东莨菪碱引起的海马神经元损伤。MEM对HAR引起震颤的影响中,实验结果显示,当腹腔注射给予大鼠10 mg/kg HAR时,可稳定获得中等程度的震颤。腹腔注射低中高（2、4、8 mg/kg）三个剂量MEM均能呈剂量依赖性地延缓HAR（10 mg/kg）诱导震颤的潜伏期（P<0.001）;另外低中剂量的MEM可缩短震颤的持续期（P<0.001）,减弱震颤程度,且低剂量效果较好（P<0.01）,高剂量的MEM反而会增大MEM的持续期和震颤强度（P<0.05或P<0.001）。海马皮层内神经递质的结果显示,给予HAR后其海马皮层内的Glu/GABA、ACh/Ch和5-HT/5-HIAA均显著升高（P<0.001）,联合MEM后,Glu/GABA和ACh/Ch显著降低（P<0.05,P<0.01或P<0.001）,而联合给药后5-HT/5-HIAA并没有降低。神经元染色结果显示,HAR可使海马神经元损伤,低中剂量的联合给药后,神经元无损伤现象,而高剂量的MEM联合HAR后,有轻微损伤。（2）去氢骆驼蓬碱与美金刚胺的药代动力学药物相互作用研究:建立了利用超高效液相-质谱联用技术同时检测MEM、HAR和HOL的生物样品分析方法,并对该方法进行了系统的方法学验证。方法学考察结果显示,在MRM模式下待测分析物和IS均未受到内源性的干扰,MEM、HAR、HOL和IS的出峰保留时间分别为:3.58,2.78,1.95和2.30 min。无残留效应,待测分析物的LLOD为0.1 ng/m L,LLOQ为0.4 ng/m L。在0.40,1.00,40.00,300.00和400.00 ng/m L五个浓度的QC样品（n=6）中,批内精密度的CV%在1.84%到8.86%之间。其准确度RE%在LLOQ下不高于17.62%,其他四个浓度则不高于9.90%。五个浓度中,批间精密度的CV%不高于6.02%,批间精密度的RE%不高于10.12%。在三个浓度的QC样品（n=6）中,待测分析物的基质效应在96.39-102.47%,其SD低于7.50%。此外,内标的基质效应为99.04±1.68%（n=6）。三个浓度下的待测分析物MEM、HAR和HOL的回收率为97.23%到104.86%,其SD不高于6.34%（n=6）。内标的回收率为102.88±0.66%（n=6）。QC样品分别于室温放置4 h、4℃冰箱放置24 h、-20℃储存一个月和反复冻融三次,经测定其SD在0.01%到16.50%之间,CV%不超过6.68%。待测分析物和IS的储备液也通过了室温24 h、4℃三天和-20℃一个月的稳定性考察。该定量分析方法灵敏快速稳定,且该方法的选择性、残留效应、批间批内精密度、基质效应、回收率和稳定性均符合生物分析方法验证指南的相关要求。利用新建立的定量测定方法,进行了HAR和MEM的药代动力学药物相互作用研究。结果显示,与MEM组相比,联合使用HAR后,MEM的AUC0-t和MRT显著升高（P<0.01或P<0.001）,联合三个剂量的HAR后,MEM的CL剂量依赖性降低（P<0.01或P<0.001）。联合给药组中MEM的Cmax低于MEM组,中、高剂量的HAR联合MEM时,MEM的Cmax均高于低剂量的HAR联合MEM组。联合给药组中HAR的Cmax高于单独给予HAR组（P<0.05或P<0.001）。联合给药组中的AUC0-t高于HAR组（P<0.05）。和单独给药组相比,联合给药组中HAR的CL有所降低（P<0.05）。在单独和联合低剂量组,部分血浆样品中HOL的浓度低于LLOQ无法绘制出完整的药时曲线。在HAR-M联合MEM组中,HOL的Cmax高于HAR-M组,MRT则HAR-H联合MEM高于HAR-H组（P<0.05）。HAR-H联合MEM组中HOL的AUC0-t高于HAR-H组（P<0.01）。HAR-H联合MEM组中的CL显著性低于HAR-H组（P<0.001）。4.结论在药效学研究方面,HAR和HAR联合MEM均对东莨菪碱诱导的记忆障碍模型和小鼠的学习记忆能力表现出明显的改善作用,并且联合给药组对记忆损伤模型的改善作用优于单独HAR组。低剂量MEM对HAR引起震颤的减弱效果高于中剂量,高剂量MEM则会增加HAR引起的震颤反应。在药动学研究方面,我们建立了灵敏快速稳定同时检测MEM、HAR和HOL的生物样品定量分析方法。药动学研究发现,HAR可以减缓MEM的代谢,增加MEM的驻留时间,进而扩大MEM的安全窗口;MEM则会增加HAR和其代谢产物HOL在大鼠血浆内的暴露。综上结论,一方面MEM会增强HAR改善学习记忆的作用,另一方面MEM有减弱HAR中枢性震颤毒性的作用,并且二者联合用药后的药代动力学特征可指导二者的联合用药。本研究为将HAR开发为新型治疗AD的有效药物、HAR的临床用药和药物相互作用提供重要的研究思路和理论基础。