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腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是肾脏替代治疗的主要方法之一。PD作为终末期肾脏病一体化治疗的初始选择方式有很多优点：延缓残余肾功能下降速度，中分子物质清除效果好，提供持续超滤，利于血压控制与液体平衡，病人有更独立的生活方式，就业率高等。PD开始的前3～5年与血液透析(Haemodialysis，HD)相比生存率基本相似。然而PD过程中，腹膜长期与含糖非生理性的腹透液持续接触、以及腹膜炎的反复发生均可介导腹膜纤维化的发生，导致超滤失败，是病人退出腹膜透析的主要原因之一，也是制约腹膜透析发展的主要障碍，目前尚无有效的解决办法。因此探讨腹膜透析相关腹膜纤维化的发生发展机制、从而寻找有效的治疗措施，是目前亟待解决的一个重要课题。
近年来的研究发现，TGF—β是重要的促纤维化因子，主要通过其下游信号蛋白Smads的活化发挥作用。研究表明肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化以及腹膜纤维化的发生发展均与TGF—β/Smad信号蛋白活化，诱导上皮或间皮细胞向肌成纤维细胞的转化(epithelial—mesenchymal transition，EMT)以及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度积聚有关。
Smad7是TGF—β/Smad信号通路的负反馈调节信号蛋白。研究证实，将Smad7基因转入肾脏、肝脏及肺脏组织中，可以通过特异性阻断Smad2/3的磷酸化显著抑制相应组织器官纤维化的发生。
本课题组的前期工作发现，腹腔内注射4.25％含糖腹膜透析液和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以成功建立大鼠腹膜透析相关腹膜纤维化模型；在腹膜纤维化的发生发展过程中，TGF—β/Smad信号蛋白显著上调和活化，提示TGF—β/Smad信号蛋白可能参与了大鼠腹膜纤维化的发生发展；进一步的研究证实，应用超声微泡技术将TGF—β抑制性信号蛋白Smad7质粒转染至大鼠腹膜组织，上调表达Smad7可通过抑制TGF—β受体调控蛋白Smad2/3的活化，显著抑制腹膜间皮细胞的转分化及细胞外基质的积聚，改善腹膜功能，提示早期上调表达Smad7对于腹膜透析相关的腹膜纤维化具有预防作用。
本研究的主要目的就探讨基因转染高表达Smad7在已经发生腹膜纤维化的大鼠腹膜透析相关腹膜纤维化是否具有治疗作用，从而进一步揭示腹膜纤维化的发生机制，并为临床治疗腹膜透析相关性腹膜纤维化提供实验基础。本研究的主要内容包括：
1、大鼠腹膜透析相关腹膜纤维化模型的建立。
2、超声微泡介导的外源性Smad7基因转染及成功表达。
3、基因转染高表达Smad7对腹膜透析大鼠腹膜纤维化的治疗作用。
一、大鼠腹膜纤维化模型的建立
目的：探讨TGF—β/Smad信号蛋白在4.25％葡萄糖腹膜透析液与LPS诱导的大鼠腹膜纤维化模型形成过程中的动态变化及意义。
方法：18只SD雄性大鼠(160～170g)，随机分为2周模型组(n=6)、4周模型组(n=6)和6周模型组(n=6)，每日腹腔内注射4.25％腹膜透析液(100mL/kg)，同时腹腔内注射LPS(0.6mg/kg，2～3次/周)。另取未做任何处理的SD雄性大鼠(n=6)作为正常对照组。分别于2周、4周和6周杀检大鼠，行腹膜平衡实验，准确量取超滤量，留取0、4小时血清与腹腔流出液标本，计算葡萄糖转运量，用光镜观察壁层腹膜组织形态结构，脏层腹膜组织用RT—PCR、Western杂交或间接免疫荧光的方法检测TGF—β1、p—Smad2/3、α—SMA、MMP—2、COL—I及PAI-1的基因和蛋白表达水平，用明胶酶谱法检测MMP—2的活性。
结果：与正常对照组比较，2周模型组壁层腹膜组织已有明显的增厚，同时伴随有超滤量的下降与葡萄糖转运量的增加；与正常对照组比较，2周、4周和6周模型组TGF—β1、p—Smad2/3、α—SMA、PAI-1、COL—I蛋白和基因水平的表达以及MMP—2活性的表达明显增强，但各模型组之间比较差异均无统计学意义。
小结：腹腔内注射4.25％葡萄糖腹膜透析液与脂多糖2周可成功诱导符合临床特征的腹膜纤维化模型；TGF—β/Smad信号蛋白的活化可能参与了葡萄糖腹膜透析液与脂多糖诱导的大鼠腹膜纤维化的发生发展。适当调整脂多糖剂量，可成功诱导在6周内腹膜纤维化持续存在且缓慢进展的动物模型。
二、超声微泡介导的外源性Smad7基因转染及成功表达
目的：利用超声微泡技术将Smad7质粒转染于已经发生腹膜纤维化的腹膜组织中，为进一步观察Smad7的治疗作用提供技术平台。
方法：(1)将pTRE—m2Smad7质粒及pEFpurop—Tet—on质粒相同质量用生理盐水稀释，每支发泡剂用5ml生理盐水溶解，二者以体积比1:1充分混匀，Smad7终浓度为100μg/ml，分别以4ml、5ml、6ml注射入腹腔，并体外超声处理，观察腹腔内液体注射量对转染效率的影响；(2)将pTRE—m2Smad7质粒及pEFpurop—Tet—on质粒相同质量用生理盐水稀释，每支发泡剂用5ml生理盐水溶解，二者以体积比1:1充分混匀，Smad7终浓度为50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml，依据前一实验结果，选择每只大鼠腹腔内注射体积为6ml，并体外超声处理，观察注射浓度对转染效率的影响；(3)实验动物给予腹腔内注射4.25％腹膜透析液和脂多糖14天后，利用超声微泡技术将Smad7质粒(终体积6ml、终浓度150μg/ml)转染于大鼠腹膜组织，并于间隔14天后再次转染，于首次转染后第0、3、7、10、14、17、21及28天杀检动物，观察转染效率，并对超声微泡的安全性进行评估。
结果：腹腔内质粒微泡混合物取注射量6ml，浓度150μg/ml时，外源基因Smad7转染效率最高，持续到14天仍有较高水平表达，间隔14天再次转染，可以获得外源基因Smad7在28天内持续较高水平的表达；外源基因在大鼠肝、肾、心、肺、脾脏以及肠管中均无表达，转染前后肝肾功能(AST、ALT、LDH、Cr)及体重无明显变化。
小结：超声介导微泡法是一种无创、无毒、高效的基因转染方法，能有效地将外源基因Smad7转染至腹膜透析模型的腹膜组织中并上调表达，为腹膜透析相关腹膜纤维化的基因治疗提供新的途径。
三、基因转染高表达Smad7对大鼠腹膜纤维化的治疗作用
目的：探讨基因转染高表达Smad7对大鼠腹膜纤维化和腹膜功能的治疗作用。
方法：24只SD雄性大鼠(160～170g)，随机分为4组：正常对照组(n=6)；腹膜纤维化模型组(n=6)，腹腔内注射4.25％腹膜透析液与脂多糖；空载体组(n=6)与Smad7治疗组(n=6)。空载体组和Smad7治疗组在与腹膜纤维化模型组相同处理的基础上，分别于第14天转染pTRE与pEFpurop—Tet—on，pTRE—m2Smad7与pEFpurop—Tet—on质粒。4周杀检大鼠，做腹膜平衡试验，准确量取超滤量，留取0、4小时血清与腹腔流出液标本，计算葡萄糖转运量，4小时后，取壁层腹膜组织作形态学观察，脏层腹膜组织用Western杂交、RT—PCR的方法检测p—Smad2/3、α—SMA、MMP—2、E—钙粘素、COL—I及PAI—I蛋白及mRNA水平的表达。
结果：腹膜组织学检查，与模型组及空载体组比较，Smad7治疗组腹膜厚度明显减轻(P<0.05)，超滤量增加(P<0.01)，葡萄糖转运量下降(P<0.05)；与模型组及空载体组比较，Smad7治疗组p—Smad2/3、α—SMA、MMP—2、COL—I及PAI—I蛋白表达水平及MMP—2活性的表达明显下调(P<0.01)，Smad7治疗组E—钙粘素蛋白表达水平明显上调(P<0.01)；α—SMA、E—钙粘素、MMP—2、COL—I及PAI-1mRNA水平的表达与其蛋白水平的表达趋势一致。
小结：TGF—β抑制性信号蛋白Smad7可通过抑制受体调控信号蛋白Smad2/3的活化，部分逆转了高糖透析液及脂多糖介导的腹膜纤维化，改善了腹膜的超滤和溶质转运功能。
总结：
1.腹腔注射4.25％腹膜透析液与脂多糖2周可成功诱导符合临床特征的腹膜纤维化模型；TGF—β/Smad信号蛋白的活化参与了葡萄糖腹膜透析液与脂多糖诱导的大鼠腹膜纤维化的发生发展。
2.超声微泡技术可以有效地将外源Smad7基因成功转染至腹膜透析相关腹膜纤维化模型的腹膜组织并显著上调表达。
3.TGF—β抑制性信号蛋白Smad7可通过抑制受体调控信号蛋白Smad2/3的活化，部分逆转高糖透析液及脂多糖介导的腹膜纤维化的发生和发展，改善了腹膜超滤和转运功能。