胆汁酸是以胆固醇为原料在肝脏内合成的两亲性分子,其主要生理功能是帮助膳食脂类和脂溶性维生素的消化和吸收。胆汁酸合成后通过胆汁酸输出泵运出肝细胞进入胆管,随后储存于胆囊中。进食后胆囊收缩释放胆汁流入肠道,绝大部分胆汁酸在回肠被重吸收通过门静脉运送回肝脏,少量随粪便排出,这一过程称为胆汁酸的肝肠循环。胆汁酸的合成、转运与排泄调控胆汁酸总量的平衡称为胆汁酸稳态,主要通过位于肝脏和肠道的特定受体及转运蛋白对胆汁酸合成、转运进行严格调控来维持。其中胆汁酸直接激活的核受体FXR起着关键作用,激活的FXR会抑制胆汁酸的合成,诱导胆汁酸转运蛋白的表达。胆汁酸合成、转运相关基因的功能受损或缺失会导致胆汁酸稳态失衡。胆汁酸稳态调控的研究主要以小鼠为模型,取得了诸多成就,但是小鼠并不能完全模拟人类胆汁酸稳态调控的所有特征,如Abcb11基因敲除的小鼠表现出轻度胆汁淤积,这与人类ABCB11基因突变导致Ⅱ型进行性家族性胆汁淤积的重度胆汁淤积并不相符,因此利用其他模式生物开展胆汁酸稳态调控研究或能拓展我们的认识。斑马鱼作为研究肝脏发育与疾病的模式生物,其优势包括养殖方便、胚胎体外受精且透明、产卵量大、易于进行遗传操作等。近年来在斑马鱼中成功模拟了Ⅱ型进行性家族性胆汁淤积、胆道闭锁等疾病,克服了啮齿动物模型不能完全模拟病人特征的局限性,为胆汁酸相关疾病发病机制带来了新的认识,这些研究表明在斑马鱼中开展胆汁酸相关研究是可行的。小鼠中胆汁酸稳态调控的研究方法分为遗传学方法和非遗传学方法,遗传学方法如构建突变体研究相关基因的功能;非遗传学方法如喂食哺乳动物胆汁酸,以胆汁酸反馈抑制通路是否被激活为评价标准。斑马鱼中能够实现相关技术操作,但这些方法是否适用于斑马鱼胆汁酸稳态调控的研究尚不清楚。为了在斑马鱼中建立胆汁酸稳态调控的研究方法,我们参考小鼠中的研究思路,使用哺乳动物胆汁酸成分处理斑马鱼,检测胆汁酸反馈抑制通路是否被激活。首先,我们鉴定了小鼠胆汁酸反馈抑制通路中的Shp、Cyp7a1在斑马鱼中的同源基因分别是nr0b2a、cyp7a1。随后,使用不同浓度的哺乳动物胆汁酸组分CA、CDCA或UDCA处理受精后3.5天的斑马鱼胚胎,处理至受精后7.5天进行数据分析。q PCR结果显示,CDCA或UDCA处理不能激活斑马鱼胆汁酸反馈抑制通路,而CA处理可以激活斑马鱼胆汁酸反馈抑制通路。进一步的研究表明,CA处理会抑制胆汁酸合成基因cyp7a1、cyp8b1、cyp27a1的表达,同时诱导肠道中的胆汁酸转运蛋白slc51a、slc10a2的表达,这与小鼠中喂食CA后的胆汁酸稳态调控相似,表明哺乳动物胆汁酸CA能够调控斑马鱼胆汁酸稳态基因的表达。我们还使用鱼类的胆汁开展实验。斑马鱼属于鲤科,鲤鱼相比斑马鱼其胆汁量大且易获得,于是我们使用不同浓度的鲤鱼胆汁处理斑马鱼探究能否影响胆汁酸稳态。q PCR结果显示,在保证幼鱼存活的前提下,鲤鱼胆汁处理不能激活斑马鱼胆汁酸反馈抑制通路,我们猜测可能原因是鲤鱼胆汁中蕴含的有毒成分所致。之后,我们使用成年斑马鱼胆汁开展实验,发现斑马鱼胆汁处理能够激活胆汁酸反馈抑制通路,且上调肝内主要的胆汁酸转运蛋白的表达,这与生理条件下肝内胆汁酸水平升高时的特征相似。为了探究斑马鱼胆汁处理后肝内胆汁酸水平是否升高,我们检测了全胚组织和除肝脏外的躯体中总胆汁酸水平,其结果一定程度上印证了这一猜想,这表明斑马鱼胆汁处理能够调控胆汁酸稳态调控基因的表达。此外,我们还从遗传学角度出发,利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中成功敲除了nr0b2a和cyp7a1基因。表型分析发现nr0b2a突变体中cyp7a1的表达升高,cyp7a1突变体中总胆汁酸水平显著降低,这与小鼠中相应突变体的表型相像。这证明了nr0b2a、cyp7a1很可能是小鼠Shp、Cyp7a1的同功基因,进一步表明CA及斑马鱼胆汁处理后检测这两个基因的相对表达量是合理的。FXR在胆汁酸稳态调控中扮演了关键作用,我们成功敲除了小鼠Fxr在斑马鱼中的同源基因nr1h4,并且对突变体进行表型分析,我们发现突变体中fxr的靶基因abcb11b和slc51a的表达显著下调,这与小鼠中的表型相似,这证明了nr1h4很可能是小鼠Fxr的同功基因。使用CA处理fxr突变体后,与对照组相比,实验组中胆汁酸合成基因与胆汁酸转运基因的表达并无明显差异,这证明CA处理对胆汁酸稳态的调控是fxr依赖性的。CA及斑马鱼胆汁处理的结果与nr0b2a、cyp7a1和fxr突变体表型分析的结果均表明:我们的研究方法可用于斑马鱼胆汁酸稳态调控研究。除了与小鼠胆汁酸稳态调控相一致的结果外,我们还发现使用CA或斑马鱼胆汁处理野生型斑马鱼胚胎后,其肝内胆管变粗,这暗示着使用CA或斑马鱼胆汁处理后,胆管内胆汁流可能增大,肝内胆汁酸水平升高。综上所述,我们从非遗传学和遗传学角度出发,建立了用于斑马鱼胆汁酸稳态调控的研究方法。我们证明了CA和斑马鱼胆汁处理以及nr0b2a、cyp7a1和fxr能够调控斑马鱼胆汁酸稳态基因的表达,这与小鼠胆汁酸稳态调控方式相一致。我们的研究为在斑马鱼中开展胆汁酸稳态调控提供了方法。