【摘 要】
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禽腺病毒（Fowl Adenoviruses,FAdVs）在世界养禽国家广泛分布,其中影响最多、最严重的是FAdV-4型（Fowl Adenovirus serotype 4）,可引起肝炎-心包积液综合征（Hydropericardium hepatitis syndrome,HHS）。自2015年以来,我国各地陆续爆发此病,给我国养禽业带来很大损失。目前对FAdV-4血清抗体检测方法报道较少,因
【基金项目】
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山西省重点研发计划重点项目:动物功能产品病控制基因工程苗关键技术研究与应用（编号:201703D211001）； “山西省1331工程”（编号:20211331-13）；
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禽腺病毒（Fowl Adenoviruses,FAdVs）在世界养禽国家广泛分布,其中影响最多、最严重的是FAdV-4型（Fowl Adenovirus serotype 4）,可引起肝炎-心包积液综合征（Hydropericardium hepatitis syndrome,HHS）。自2015年以来,我国各地陆续爆发此病,给我国养禽业带来很大损失。目前对FAdV-4血清抗体检测方法报道较少,因此,需要研发一种检测FAdV-4抗体的ELISA方法。本研究将Fiber-2全基因克隆入pET-32a表达载体,构建了pET32a-Fiber2原核表达质粒,进行了目的蛋白的表达和纯化,并利用纯化的蛋白建立了FAdV-4 Fiber2抗体ELISA检测方法。1.将pET32a-Fiber2表达质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）,进行原核表达。Fiber-2蛋白诱导表达的IPTG最佳浓度为0.1 mmol/L、最佳诱导时间为10 h。SDS-PAGE证明Fiber-2蛋白主要以包涵体的形式存在。目的蛋白纯化后浓度为1.5 mg/m L。Western Blot证实Fiber-2蛋白具有良好的反应原性,可与FAdV-4抗体反应产生单一条带。表明纯化Fiber-2蛋白可作为ELISA包被抗原检测血清抗体。2.将纯化的Fiber-2蛋白作为包被抗原,建立了FAdV-4抗体ELISA检测方法。ELISA方法的优化条件为:抗原最佳包被浓度为1.25μg/m L,包被液为p H 7.2碳酸盐缓冲液,抗原包被时间为37℃1 h后4℃过夜,封闭液为5%脱脂乳,血清和酶标二抗稀释液为5%脱脂乳,血清最佳稀释度为1∶200,血清最适作用时间为37℃15 min,酶标二抗最佳稀释度为1∶7500,酶标二抗最适作用时间为37℃60 min。ELISA方法的临界值为0.104,大于等于0.104为阳性,小于0.104为阴性。3.建立的ELISA方法与其他阳性血清不发生特异性反应,特异性好;检测敏感度高,可达1∶12800;组内与组间试验的变异系数均小于10%,具有良好的重复性。抗原包被酶标板在4℃条件下保存6个月,其特异性和敏感性均保持良好。建立的ELISA与血清病毒中和试验（VNT）检测结果一致,具有很高的可靠性。本研究用原核表达、纯化的Fiber-2蛋白成功建立了一种特异性好、敏感度高、重复性好、可靠性高的FAdV-4 Fiber-2抗体ELISA检测方法,为FAdV-4流行病学调查及疫苗免疫效果评估提供了有效手段。
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