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研究背景及目的当前,儿科人群用药安全是研究者们关注的要点。近几十年来,由于缺乏儿科人群临床试验资料、超说明书使用、用药不当、多药使用等多重原因,发育尚未完全的儿童比成人更易发生药物不良反应(Adverse Drug Reactions,ADRs),其中骨毒性反应对于儿科人群的生长发育造成严重影响,代表药物有喹诺酮类药物、糖皮质激素、抗癫痫类药物等。因此21世纪初开始,国内外多个指导原则均指出,当药物对儿童的骨结构或骨代谢产生不良反应时,需开展专门针对于骨毒性的幼年动物试验以解决上述担忧。与此同时,幼年动物骨毒性试验还可为具有潜在骨毒性风险的药物提供安全性评价。自20世纪70年代,日本暴发“痛痛病”以来,已有大量文献报道了镉(Cadmium,Cd)与Cd的化合物对人类及动物的骨毒性反应,其中研究者们针对Cd引起的骨质疏松症展开了广泛且深入的研究,但通过查阅大量文献及资料发现,Cd与Cd的化合物对于婴幼儿或断乳前幼年动物的骨毒性研究较少。因此本研究选用氯化镉(Cadmium Chloride,CdCl2)作为阳性药物,以幼年SD大鼠作为试验对象,旨在探究CdCl2对幼年斯普拉格-道利(Sprague-Dawley,SD)大鼠骨发育的影响,同时筛选骨发育指标并建立骨组织形态学、骨密度(Bone Mineral Density,BMD)和骨代谢指标的评价方法,期望为具有潜在骨毒性的药物提供安全性评价,最终提高儿科用药安全。研究方法与结果本研究分为两个部分:第一部分:幼年SD大鼠经口灌胃给予CdCl2四周重复给药剂量范围探索实验。设计1个溶剂对照组0 mg/kg/day(去离子水)与三个CdCl2剂量组,即0.5mg/kg/day(低剂量组)、2.5 mg/kg/day(中剂量组)、10 mg/kg/day(高剂量组),每组6只,雌雄各半。于出生后(Postnatal Day,PND)第7天开始口服灌胃给药。由于PND7-8给药后中、高剂量组幼鼠体重降低、行动迟缓、精神状态不佳,故于PND9将剂量调整为0.5 mg/kg/day(低剂量组)、1.5 mg/kg/day(中剂量组)和5 mg/kg/day(高剂量组)。结果表明:各剂量组幼鼠均未见死亡,与对照组相比,各剂量组幼鼠的体重受到影响,中、高剂量组幼鼠的骨骼生长及发育受损,且存在肾毒性、贫血及炎症反应。第二部分:幼年SD大鼠经口灌胃给予CdCl2九周重复给药骨毒性实验。采用剂量范围探索实验中调整后的CdCl2剂量,即0/0.5/1.5/5 mg/kg/day,每组16只,雌雄各半,建立幼年SD大鼠骨毒性模型,于PND8开始给药,重复九周。给药期间,临床观察、体重检测每天一次;断乳后,顶臀长与摄食量检测分别1次/周和2次/周;给药结束后,采集血液进行临床病理检测及骨代谢指标检测,采集脏器进行组织病理学检查及建立骨毒性评价方法。主要结果如下:Ⅰ:5 mg/kg/day CdCl2可影响幼鼠的体重、骨长度与重量发育;各剂量的CdCl2均对断乳后幼鼠的摄食量有影响,但随着幼鼠年龄增长,给药期末时各剂量组幼鼠的摄食量逐渐恢复。Ⅱ:光镜下见高剂量组幼鼠骨干前端的骨小梁数量减少、变薄且稀疏。微型计算机断层扫描技术(Micro Computed Tomography,Micro-CT)图像显示,高剂量组幼鼠的骨骺端中心变大、松散、断裂,具有空心形状,骨干端骨小梁的数目严重减少。高剂量组幼鼠的骨体积(BV)、骨面积(BS)、骨体积比(BV/TV)、骨面积比(BS/TS)、骨小梁数目(Tb.N)及厚度(Tb.Th)可见显著减少,骨小梁连接度(Tb.Sp)可见显著性增加。Ⅲ:Micro-CT所测的高剂量组雌雄幼鼠右股骨BMD见极显著性降低(P<0.01);双能X射线骨密度仪(Dual-energy X-ray Absorptionmetry,DXA)所测的高剂量组雄性幼鼠右胫骨BMD见显著性降低(P<0.05),而雌性幼鼠未见显著性差异。Ⅳ:各剂量组幼鼠骨钙(Calcium,Ca)、磷(Phosphorus,P)浓度均有一定程度降低,各剂量组骨和血清Cd含量均显著增加,且有剂量-反应关系。高剂量组的雌性幼鼠降钙素(Calcitonin,CT)浓度极显著升高(P<0.01);中、高剂量组幼鼠的血清甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone,PTH)浓度极显著升高(P<0.01)。各剂量组幼鼠血清中骨钙素(Osteocalcin,OC)和I型胶原交联羧基末端肽(TypeⅠCollagen Cross-linked C-Telopeptide,CTX-Ⅰ)浓度均有不同程度的下降。研究结论1.四周重复给药骨毒性试验可基本确定CdCl2的剂量范围,初步认为CdCl2可影响幼年SD大鼠的骨生长发育,且对其肾脏有一定损伤。2.九周重复给药骨毒性试验表明5 mg/kg/day CdCl2已严重延缓幼鼠的骨生长发育,骨微结构及骨小梁的数目、形态已受到破坏,骨和血Ca、P含量失调,骨代谢调控激素紊乱,骨形成与骨吸收功能失衡。3.本研究筛选出骨发育指标,并建立幼年SD大鼠骨毒性临床前安全性评价方法,包括骨组织形态学检测、BMD检测、骨代谢指标检测。