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动脉粥样硬化斑块引起的管腔狭窄及斑块破裂、血栓形成,是心肌缺血、急性心肌梗死等急危重症发病的根本原因。细胞焦亡是由inflammasomes介导的新型促炎性细胞死亡方式,焦亡过程中伴随大量炎性因子的释放,影响动脉粥样硬化发生、发展以及斑块的稳定性。细胞凋亡是经典的程序性细胞死亡途径,可通过影响血栓形成、斑块破裂等参与动脉粥样硬化的发生与进展。活血解毒Ⅰ号方是陈可冀院士及其团队在芎芍胶囊的基础上加味而成,包括川芎、赤芍、黄连,课题组前期研究已经证实,活血解毒Ⅰ号方稳定斑块作用优于单纯活血,其机制与抑制炎症反应、调节血脂、改善胶原沉积及代谢有关,尤以抑制炎症反应为主。活血解毒Ⅰ号方是防治AS的有效方药,基于免疫炎症反应干预AS发生发展过程、稳定斑块等方面具有很好的实验证据,其如何通过inflammasomes途径发挥抗炎及免疫调节作用?Inflammasomes介导的免疫炎症反应在内皮细胞、巨噬细胞的不同程序性死亡过程中（凋亡/焦亡）发挥了重要作用,其下游caspases家族是细胞焦亡与细胞凋亡之间相互串话和转化的关键蛋白,活血解毒Ⅰ号方对其有何作用?上述问题待解答。基于inflammasomes/caspases信号通路、瘀毒理论及活血解毒Ⅰ号方前期研究基础,提出如下假说:活血解毒Ⅰ号方通过调控inflammasomes/caspases信号通路,减少炎症因子的释放,抑制程序性细胞死亡（凋亡、焦亡）的发生,发挥抗炎及免疫调节作用,起到抑制动脉粥样硬化形成和稳定斑块的作用。围绕上述科学假说,分别开展网络药理学研究和动物实验两部分研究内容:网络药理学采用网络数据库,实验研究采用高脂饲料饲养的ApoE-/-小鼠为动脉粥样硬化动物模型,观察活血解毒Ⅰ号方对小鼠血脂、动脉粥样硬化病变程度及斑块稳定性、细胞焦亡水平、凋亡水平及相关炎症因子表达的影响,旨在阐释其调控细胞焦亡、凋亡,抑制动脉粥样硬化的形成、稳定斑块的作用和抗炎免疫调节机制。研究一基于网络药理学探讨活血解毒Ⅰ号方抗动脉粥样硬化的作用机制目的:应用网络药理学方法分析活血解毒Ⅰ号方抗动脉粥样硬化的分子机制。方法:通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索活血解毒Ⅰ号方活性成分及其靶点,并在Uniprot蛋白质数据库标准化蛋白质靶点信息;通过OMIM、GeneCards、DRUGBANK数据库获取动脉粥样硬化相关靶点基因,筛选药物和疾病共同靶点,利用CytoScape3.8.2软件构建“成分-靶点”网络,筛选关键活性成分;通过STRING平台进行蛋白质互作分析,构建共同靶点PPI网络,筛选关键靶点基因;采用Matascape数据库进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析,构建“药物-靶点-通路”多维网络图。结果:共筛选出活血解毒Ⅰ号方25个活性成分,214个潜在靶点,与1265个动脉粥样硬化疾病靶点交集,筛选出共同靶点118个。活血解毒Ⅰ号方治疗动脉粥样硬化的关键活性成分槲皮素、黄芩素、β-谷甾醇、鞣花酸、小檗浸碱、非洲防己碱、小檗碱等调控 TNF、AKT1、IL6、VEGFA、TP53、IL1B、JUN、CASP3、PTGS2、PPARG等相关靶点,干预机体细胞凋亡、细胞迁移、细胞运动、血管进展、活性氧代谢过程等生物学过程,并可能通过TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞凋亡、T细胞受体信号通路、MAPKs信号通路、FoxO信号通路等对动脉粥样硬化的发生发展产生影响。结论:初步揭示了活血解毒Ⅰ号方治疗动脉粥样硬化的“多成分-多靶点-多通路”作用网络,为活血解毒Ⅰ号方治疗动脉粥样硬化提供了理论依据和研究思路。研究二 活血解毒Ⅰ号方基于inflammasomes/caspases通路干预ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的机理研究目的:观察活血解毒Ⅰ号方对小鼠血脂、动脉粥样硬化病变程度及斑块稳定性、细胞焦亡水平、凋亡水平及相关炎症因子表达的影响,并基于inflammasomes/caspases通路阐释其部分作用机理。方法:84只ApoE-/-小鼠高脂饲料饲养12周,随机分为模型组、他汀组（阿托伐他汀,10mg/Kg/d）、活血解毒Ⅰ号方组（2.171g/Kg/d）、活血解毒Ⅰ号方+他汀组（活血解毒Ⅰ号方2.171g/Kg/d+阿托伐他汀10mg/Kg/d）、AC抑制剂组（Caspase-1特异性抑制剂,2mg/Kg/次）、AC抑制剂+活血解毒Ⅰ号方组（AC抑制剂2mg/Kg/次+活血解毒Ⅰ号方2.171g/Kg/d）各14只,另有ApoE-/-小鼠10只普通饲料饲养作为普食组,C57BL/6J小鼠14只作为正常对照组。AC抑制剂分别于第13周、17周、21周的首日腹腔注射一次,余各组小鼠灌胃给药12周。采用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平;采用HE染色和Movat染色方法评估动脉粥样硬化病变程度及斑块稳定性;透射电镜观察主动脉壁动脉粥样硬化斑块中各细胞形态,免疫组织化学法检测主动脉组织中焦亡标志性蛋白GasderminD表达水平;采用ELISA法检测血清IL-1β、IL-18水平,qPCR法检测主动脉组织中炎症小体通路相关分子NLRP1、NLRP3、AIM2、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18基因表达水平,Western blot法检测主动脉组织中NLRP1、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达水平;采用Western blot法检测主动脉组织中凋亡相关分子Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达水平;采用Western blot法检测主动脉组织中炎症因子IL-6、TNF-α、hs-CRP、NF-κBp65蛋白表达水平。结果:血脂检测显示,模型组较正常对照组、普食组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平明显升高（P＜0.05）,HDL-C水平明显降低（P＜0.05）;与模型组相比,他汀组、活血解毒Ⅰ号方组、活血解毒Ⅰ号方+他汀组、AC抑制剂组、AC抑制剂+活血解毒Ⅰ号方组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平明显降低（P＜0.05）,HDL-C水平明显升高（P＜0.05）;与他汀组相比,活血解毒Ⅰ号方+他汀组进一步降低TC、TG水平。HE染色结果显示,正常对照组主动脉管壁平滑,未见斑块沉积,余各组主动脉管腔均可见不同程度的斑块沉积,其中模型组最为显著,各干预组斑块沉积程度较模型组均有不同程度的减轻。与普食组比较,模型组斑块面积占血管面积的比例显著升高（P＜0.05）,与模型组比较,他汀组、活血解毒Ⅰ号方组、活血解毒Ⅰ号方+他汀组、AC抑制剂组、AC抑制剂+活血解毒Ⅰ号方组斑块面积占血管面积的比例显著降低（P＜0.05）。Movat染色结果显示,与普食组比较,模型组斑块易损指数显著升高（P＜0.05）,与模型组比较,他汀组、活血解毒Ⅰ号方组、活血解毒Ⅰ号方+他汀组、AC抑制剂组、AC抑制剂+活血解毒Ⅰ号方组斑块易损指数显著降低（P＜0.05）。透射电镜可见小鼠主动脉动脉粥样硬化斑块中内皮细胞凋亡、巨噬细胞焦亡现象;模型组较正常对照组、普食组小鼠主动脉组织GasderminD蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,他汀组、活血解毒Ⅰ号方组、活血解毒Ⅰ号方+他汀组、AC抑制剂组、AC抑制剂+活血解毒Ⅰ号方组小鼠主动脉组织GasderminD蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。炎症小体通路（细胞焦亡）相关分子的检测:ELISA结果显示,模型组较正常对照组、普食组小鼠血清IL-1β、IL-18水平明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,他汀组、活血解毒Ⅰ号方组、活血解毒Ⅰ号方+他汀组、AC抑制剂组、AC抑制剂+活血解毒Ⅰ号方组小鼠血清IL-1β、IL-18水平明显降低（P＜0.05）;与他汀组相比,活血解毒Ⅰ号方+他汀组进一步降低IL-1β水平。主动脉组织qPCR检测结果显示,模型组较正常对照组、普食组小鼠主动脉组织中NLRP1、NLRP3、AIM2、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,他汀组 NLRP3、AIM2、ASC、IL-1β、IL-18 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）,活血解毒Ⅰ号方组和活血解毒Ⅰ号方+他汀组NLRP1、NLRP3、AIM2、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）,AC 抑制剂组NLRP3、AIM2、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）,AC抑制剂+活血解毒Ⅰ号方组NLRP3、AIM2、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）;与他汀组相比,活血解毒Ⅰ号方+他汀组进一步降低NLRP1、NLRP3、AIM2、Caspase-1mRNA表达水平（P＜0.05）,AC抑制剂组、AC抑制剂+活血解毒Ⅰ号方组进一步降低Caspase-1mRNA表达水平（P＜0.05）。Western blot检测结果显示,模型组较正常对照组、普食组小鼠主动脉组织中NLRP1、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,他汀组小鼠主动脉组织中ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）,活血解毒Ⅰ号方组和活血解毒Ⅰ号方+他汀组NLRP1、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）,AC抑制剂组和AC抑制剂+活血解毒Ⅰ号方组NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）;与他汀组相比,活血解毒Ⅰ号方+他汀组进一步降低NLRP1、NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平（P＜0.05）,AC抑制剂组、AC抑制剂+活血解毒Ⅰ号方组进一步降低Caspase-1蛋白表达水平（P＜0.05）。凋亡相关分子的检测:模型组较正常对照组、普食组小鼠主动脉组织中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,他汀组、活血解毒Ⅰ号方组、活血解毒Ⅰ号方+他汀组、AC抑制剂组、AC抑制剂+活血解毒Ⅰ号方组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）;与他汀组相比,活血解毒I号方+他汀组进一步降低Caspase-9蛋白表达水平（P＜0.05）。炎症因子检测:模型组较正常对照组、普食组小鼠主动脉组织中IL-6、TNF-α、hs-CRP、NF-κB p65蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,他汀组、活血解毒Ⅰ号方组、活血解毒Ⅰ号方+他汀组IL-6、TNF-α、hs-CRP、NF-κBp65蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）,AC抑制剂组NF-κBp65蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）,AC抑制剂+活血解毒Ⅰ号方组TNF-α、hs-CRP、NF-κBp65蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）;与他汀组相比,活血解毒Ⅰ号方+他汀组进一步降低IL-6、TNF-α蛋白表达水平（P＜0.05）。结论:活血解毒Ⅰ号方可降低ApoE-/-小鼠血脂及炎症因子水平,改善脂质代谢和炎症反应,抑制主动脉斑块形成,增加斑块稳定性,从而发挥抗动脉粥样硬化作用。其抗动脉粥样硬化的机制可能与活血解毒Ⅰ号方调控炎症小体NLRP1-NLRP3/ASC/Caspase-1/IL-1β 通路,抑制细胞焦亡;抑制 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达,调控内外源性细胞凋亡通路抑制细胞凋亡的发生有关。