组织工程领域正在研究制定新的特定疗法,以满足当前迫切需要的组织修复和再生。由外伤、骨骼疾病、先天性畸形、感染、肿瘤切除等引起的骨缺损,是骨科和创伤外科的一大挑战。二十世纪末在美国每年有七十万人患有骨折、骨骼肌肉疾病,耗费高达2150亿美元,随着人口老龄化,这些数字仍在迅速增加,而在中国患有此类疾病的人数可能更多。自体骨移植被认为是骨缺损治疗的金标准,然而,自体骨移植有供体部位感染、骨量供应受限及手术时间延长等不足,因此,在过去几十年里,用于骨组织再生的骨替代材料(bone substitute material,BSM)越来越多的引起了医学界的关注。近二十年的研究中,磷酸钙骨水泥(Calcium Phosphate Cement, CPC)由于其良好的生物相容性、生物活性和骨传导性已被认为是最有前景的骨移植替代物之一。在本课题组以前的研究中,一种改良的CPC被证实具有优异的机械性能,更快的降解速率并能更好的提高细胞生存力,而且作为一种新型材料评估了其理化性质和体外细胞兼容性能。作为构建骨组织工程的三大因素支架材料、种子细胞、诱导成骨的细胞因子之一的种子细胞,其中最有前景的干细胞被研究表明其与材料支架复合用于骨组织再生展现出令人振奋的结果。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)被认为是一种存在于骨髓中的成纤维样多能干／祖细胞,具有强大可塑性和灵活生长性,不仅可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等间质组织,在体外特定的条件下,能够被诱导分化为中胚层、外胚层以及内胚层组织和细胞。正是基于BMMSCs的这种强大的分化潜能及易于分离扩增培养、遗传稳定、植入体内后免疫排斥反应较弱等特性使其在组织工程、细胞治疗、基因治疗等领域的应用日益广泛。不像胚胎干细胞存在伦理方面问题,BMMSCs更利于将来临床应用。富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)是新型的自体生长因子来源,可自体抽取血液制备,能在骨缺损局部释放高浓度的自体活性生长因子系统。PRP中富含有大量的生长因子,如血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF),转化生长因子-β1(Transforming growth Factorl β1,TGF-β1),类胰岛素生长因子(Isulin-like growth factor,IGF),表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF),血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等。自1998年以来,Marx等在88例患者应用PRP复合自体骨成功修复下颌骨连续性缺损以来,PRP作为自体生长因子来源得到越来越广泛的关注和应用。干细胞接种密度对于细胞增殖、分化和细胞外基质的合成起关键作用。以往研究表明,较高的细胞密度可增加细胞外基质的合成,如胶原蛋白。更高的接种密度也获得了较高的ALP和矿化物质。然而,BMMSCs不同密度接种到CPC支架上的影响尚未见报道,并且CPC与BMMSCs、PRP构建组织工程骨的可行性及其骨修复效果仍是未知领域。因此,该项研究的目的是探讨骨髓间充质干细胞不同初始接种密度对细胞增殖和成骨分化效果的影响,以试图发现最佳接种密度。在此基础上我们设计采用CPC结合BMMSCs及PRP构建组织工程骨并修复小型猪股骨髁标准骨缺损的体内研究,以明确CPC作为组织工程骨中的核心作用,并评估复合型CPC/BMMSCs/PRP组织工程骨的骨修复作用。基于以上两个目的,本研究主要包括两个部分：第一部分为接种密度对骨髓间充质干细胞复合生物功能化磷酸钙骨水泥支架的细胞增殖和成骨分化的影响；第二部分为骨髓间充质干细胞与富血小板血浆复合功能化磷酸钙骨水泥构建组织工程骨修复小型猪股骨标准骨缺损的实验研究；第三部分,针对当下研究较热的新型干细胞-人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells, hUCMSCs)的生物学特性研究进展进行了综述,以供参考。第一部分：接种密度对骨髓间充质干细胞复合生物功能化磷酸钙骨水泥支架的细胞增殖和成骨分化的影响目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)的不同初始接种密度至磷酸钙骨水泥(Calcium Phosphate Cement,CPC)支架上对细胞增殖和成骨分化效果的影响,并验证骨髓间充质干细胞与磷酸钙骨水泥的生物相容性。方法：用高温炉在1500℃温度下煅烧钙/磷比约为1.9(1.5～2.0)的磷酸氢钙(CaHPO4, calciumphosphatedibasic, DCPA)和碳酸钙(calciumcarbonate, CaCO3)混合物生成TTCP (Ca4[PO4]2O),将磷酸四钙TTCP (Ca4[PO4]2O)与磷酸氢钙DCPA(CaHPO4)以摩尔质量比1：1混合制备CPC粉末,与去离子水混合后制备直径12mm、高度2mm的圆饼状CPC支架。原代培养西藏小型猪骨髓间充质干细胞至第3代,按三种细胞接种密度1mol/ml、5mol/ml、25mol/ml接种至CPC支架上成骨诱导培养1、4和8天；扫描电镜观察细胞黏附形态,EdU法检测细胞增殖率,活/死细胞染色试剂盒检测活细胞百分比、单位面积活细胞数,茜素红染色法检测矿物质合成,RT-PCR法检测成骨基因ALP、OC、 Coll-1、Runx-2的mRNA的表达。比较各项指标三种接种密度间的差异。结果：扫描电镜显示BMMSCs在CPC支架表面粘附扩展良好；EdU法结果表明BMMSCs的细胞增殖率随着在CPC上黏附生长时间的延长而降低,在接种1d时1、5、25mol/mL接种密度间差异有统计学意义(F=56.262,P=0.000),而进一步LSD法显示5mol/mL与25mol/mL组间差异无统计学意义(P=0.090),类似结果也出现在接种8d时；LIVE/DEAD染色结果显示随着时间增加,BMMSCs在数量上迅速增加,单位面积活细胞数也迅速增多,8d时活细胞百分比增加到93%以上,单位面积活细胞数增至558个/mm.2。活细胞百分比5mol/mL组与25ol/mL组在接种4d时采用LSD法显示差异无统计学意义(P=0.215),8d时也无统计学意义(P=0.230)。在8d时5mol/mL组与25mol/mL组单位面积活细胞数LSD法显示差异无统计学意义(P=0.199)；茜素红染色显示CPC支架表面有一层新生矿物基质被茜素红染成红色,且随着初始接种密度升高红色渐深；RT-PCR结果显示三种接种密度的ALP基因表达1d时最低,峰值均出现在4d,此时,5、25mol/mL组ALP表达量分别是1mol/mL组的2.6、2.8倍,而5mol/mL组与25mol/mL组之间LSD法检测差异无统计学意义(P=0.746)。而OC、Coll-1、Runx2基因表达在观察时间内培养8d时见明显升高,此时5mol/mL组与25mol/mL组的比较差异均无统计学意义(F=1.131,P=0.383;F=3.940,P=0.081；LSD法P=0.211)。结论：BMMSCs接种到CPC上具有理想的黏附性能和增殖活性,更高的BMCM SC的初始接种密度不一定更好,最佳的细胞接种密度应用在一个特定的干细胞支架结构上,更利于细胞的增殖,分化和细胞外基质的合成,将BMCMSC细胞稀释成2mL接种到直径为12mm、高度为2mm的CPC支架上并使用24孔板培养时,最佳的细胞接种密度在5mol/mL至25mol/mL之间。第二部分：骨髓间充质干细胞与富血小板血浆复合大孔隙磷酸钙骨水泥支架构建组织工程骨修复小型猪股骨标准骨缺损的实验研究目的：明确CPC作为组织工程骨中的核心作用,并评估复合型CPC/BMMSCs/PRP组织工程骨的骨修复作用。方法：按第一部分方法制备CPC粉末,与去离子水混合后经发泡机制备直径8mm、高度10mm的圆柱状大孔隙CPC支架。将第三代BMMSCs经成骨诱导培养2周时经成骨染色检测后参照第一部分结果将1×106个细胞重悬于100μl成骨诱导培养液中缓慢逐滴注到CPC支架的顶部(1×106个细胞／支架),植入动物体内前培养24小时。动物术前及时抽取前腔静脉血用密度梯度离心法制备新鲜PRP,激活后随CPC支架植入体内。共10头西藏小型猪,在8周和12周观察时间点各五头。每头小型猪随机选取四条腿分别作为空白组、CPC组、CPC/BMMSCs组、CPC/BMMSCs/PRP组,将相应生物材料植入骨缺损中。于8周和12周时拍摄数字X线片后处死动物,显微CT扫描观察分析材料降解及新生骨生成情况,组织学观察拍照并计算新生骨染色面积与总面积的百分比,并比较各组间差异。结果：成骨诱导液培养14天时碱性磷酸酶染色可见黑褐色钙盐沉积、茜素红染色可见红色钙结节堆积；X线结果显示了植入后8周时材料和宿主骨组织之间已有明显的生物反应。在植入12周,该材料大部分被降解吸收并有新生骨桥形成；不论在第8周还是第12周CPC组、CPC/BMMSCs组、CPC/BMMSCs/PRP组三个组的CPC降解程度均呈增加趋势。剩余材料体积分数定量分析第8周三组间差异无统计学意义(F=0.458,P=0.670),同样第12周三组间差异无统计学意义(F=3.136,P=0.117)。而CPC组从第8周至12周剩余材料的降解有统计学意义(F=102.677,P=0.002),类似结果出现在CPC/BMMSCs组、CPC/BMMSCs/PRP组；随着时间延长,新生骨量不断在增加,在第8周CPC组与空白组无显著差异(LSD法,P=0.156),而CPC/BMMSCs组、CPC/BMMSCs/PRP组均与空白组差异显著(P=0.022与P=0.010),CPC/BMMSCs/PRP组的新生骨量与CPC组差异有统计学意义(P=0.047)；同样的结果出现在第12周。CPC/BMMSCs组的新生骨量比CPC组高,但第8周无统计学意义(P=0.133),至第12周有统计学意义(P=0.025)。表明CPC在添加了干细胞(CPC/BMMSCs组)或者生长因子(CPC/BMMSCs/PRP组)后构建的组织工程骨比自身修复骨缺损(Blank组)能力强；骨组织切片发现CPC组、CPC/BMMSCs组、CPC/BMMSCs/PRP组的新生骨量渐增。定量分析发现第8周时三个实验组的新生骨体积分数由11.51%上升至16.88%,CPC/BMMSCs组、CPC/BMMSCs/PRP组与CPC组间的差异均有统计学意义(P=0.048,P=0.008)。第12周时CPC组新生骨体积分数为15.46%, BMMSCs/PRP/CPC组最高为26.00%,且后两组与CPC组相比较差异均有统计学意义(P=0.014,P=0.001)。从第8周至第12周的组织学定量差异仅CPC组有统计学意义(P=0.041),其他两个实验组均无统计学意义(P=0.169,P=0.252)。表明BMMSCs与PRP有助于骨组织的愈合,与CPC复合后比单纯的CPC修复效果好。结论：CPC是一种用于基准骨缺损治疗有效的骨替代品,体内实验中其展现出了优良的骨引导性并支持骨再生。联合使用BMMSCs和PRP可改善CPC的降解率,并促进新生骨形成。