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适当控制角膜上皮的伤口愈合对角膜健康至关重要,涉及到细胞增殖、迁移、锚定和分化。透明质酸钠(SH)已被证实对角膜伤口愈合具有积极的药理学作用,但具体机制尚未阐明。在此基础上,我们拟采用体外细胞实验来探讨miRNA在SH刺激角膜上皮伤口愈合中的作用和机制。第一章参与调节透明质酸钠促进角膜上皮伤口愈合的miRNA表达谱测定[目的]分析SH处理后人角膜上皮细胞(HCECs)中miRNA的差异表达。[方法]细胞分两组:对照组常规培养在KGM-2中,实验组培养基加入0.6mg/ml SH。提取RNA,微阵列分析miRNA差异表达,定义log2FC≥1.5或≥-1.5,adjP<0.05。RT-qPCR验证差异表达最明显的miRNA。[结果]SH 组 miR-18a、miR-92 表达显著下调,miR-210、miR-26b 和 miR-378 表达上调,miR-18a差异表达最明显。RT-qPCR示miR-18a下调最显著,miR-92紧随其后。[结论]miR-18a在SH处理的HCECs中显著下调,可能为关键miRNA。第二章miR-18a表达失调对IHCECs生物学特性的影响[目的]分析miR-18a上调或下调对HCECs生物学特性的影响。[方法]脂质体转染 HCECs,分三组:miR-18a mimics、miR-18a antagomir 组和Scrambled 对照组。转染后 24h、48h、72h,RT-qPCR 检测 miR-18a 的表达。MTT法检测波长570nm的吸光度值。[结果]RT-qPCR示,与Scrambled组相比,miR-18a在mimics组显著上调,在antagomir组显著下调,表达差异随时间推移逐渐缩小。MTT法示antagomir组HCECs细胞活力高于Scrambled对照组,mimics组细胞活力显著低于Scrambled组,表达差异随时间推移逐渐减小。[结论]miR-18a失表达影响HCECs生物学特性,可确定为SH促进HCECs增殖的效应器。第三章miR-18a靶向CTGF调节透明质酸钠促进角膜上皮伤口愈合[目的]预测miR-18a的可能靶基因并进行验证;分析靶基因是否对SH处理HCECs进行调控。[方法]TargetScan与通路富集分析预测miR-18的靶基因。细胞转染分四组:miR-18a mimics、antagomir、Scrambled Control 和 SH+Scrambled 组,Western blot、RT-qPCR检测miR-18a失表达对靶基因的影响。双荧光素酶报告分析miR-18a对靶基因的转录水平影响。脂质体转染技术沉默SH处理HCECs中的靶基因,RT-qPCR、Western blot检测沉默效率,MTT法检测靶基因沉默对SH处理HCECs增殖的影响。Transwell migration和划痕实验检测靶基因沉默对SH处理HCECs迁移的影响。[结果]miR-18a预测靶基因富集于Arf6下游通路,预测为CTGF。mRNA和蛋白质水平上,miR-18a高表达/低表达分别抑制/增强HCECs中CTGF的表达,SH+Scrambled组CTGF表达显著高于Scrambled组。双荧光素酶报告证明miR-18a 与 CTGF 3’UTR 结合。与 Scrambled 组相比,SH 处理 HCECs 在 CTGF沉默后24h、48h、72h细胞生长速率显著降低,24h划痕愈合程度、细胞迁移距离显著低下。[结论]CTGF是miR-18a的靶基因。miR-18a对CTGF具有抑制作用。miR-18a靶向CTGF,在SH促进角膜上皮伤口愈合中发挥始动作用。