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目的本研究首先通过急性毒性实验和长期毒性实验系统评价扶正膏临床使用剂量的安全性;进而以免疫功能低下小鼠模型为研究对象,明确扶正膏对免疫功能低下的影响;最后以扶正膏增强细胞免疫功能为切入点,探究扶正膏增强细胞免疫功能的可能作用机制,以期为扶正膏的临床使用提供分子生物学依据。方法1.扶正膏临床前安全性评价1.1急性毒性研究本研究以《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》为指导原则,通过给与14天不同浓度的扶正膏水溶液,以体重、饮食、外观等客观指标为观察内容,进行急性毒性实验评价。1.2长期毒性研究本研究以《中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则》为指导原则,通过给与90天不同浓度的扶正膏水溶液,进行如下指标的观察与检测:（1）一般状况观察:体重、摄食量。（2）血液学指标:白细胞、红细胞计数及其分类、血小板、凝血酶原时间等。（3）血液生化学指标:天门冬氨酸转移酶、谷氨酸转移酶、肌酐、尿素氮、总蛋白、白蛋白、血糖、总胆固醇、钠离子、钾离子、氯离子等。（4）尿液检查指标:尿液外观、比重、PH值、尿蛋白、尿胆红素、白细胞等。（5）脏器指数和组织病理学检查:肝脏、脾脏、心脏、肾脏、脾脏、肾上腺、胸腺、睾丸（雄鼠）、子宫（雌鼠）。2.扶正膏对免疫功能低下的影响本研究以腹腔注射80mg/kg环磷酰胺3天复制免疫功能低下小鼠模型,模型复制之后给与不同浓度的扶正膏水溶液,分别为正常组（Contrl）、模型组（Model）、扶正膏低剂量组（FZG-L）、扶正膏中剂量组（FZG-M）、扶正膏高剂量组（FZG-H）、阳性对照药玉屏分散组（YPF）、阳性对照药左旋咪唑组（LYC）,以各组小鼠体重,脾脏指数、胸腺指数,脾脏及胸腺病理学检查,血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM,血清细胞因子IL-2、γ-干扰素（IFN-γ）,脾脏中CD4+、CD8+T淋巴细胞的比例,以及体液免疫、细胞免疫、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性等内容作为免疫功能的评价指标,明确扶正膏对免疫功能低下的影响。3.扶正膏增强细胞免疫功能机制初探复制免疫功能低下小鼠模型,利用Wsetern Blot技术检测脾脏组织中TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6等蛋白的表达情况。接着体外分离、培养正常小鼠脾淋巴细胞,分组为正常组、扶正膏含药血清组、抑制剂组、扶正膏含药血清+抑制剂组,使用MyD88抑制剂ST2825和扶正膏含药血清干预后,检测细胞上清液中IL-2、IFN-γ的变化,同时Wsetern Blot技术检测各组脾淋巴细胞中TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6的蛋白表达变化。结果1.扶正膏临床前安全性评价1.1急性毒性研究与正常组相比,扶正膏低、中、高剂量组（最大给药量且相当于临床用药101倍）体重均与正常组无明显差异,且小鼠精神状态佳,未出现死亡,未测得半数致死量(LD50),说明扶正膏无毒性。1.2长期毒性研究与正常组相比,扶正膏低、中、高剂量组（相当于临床用药71倍）体重、摄食量、精神状态均与正常组无明显差异。血液学指标:凝血功能、白细胞计数（WBC#）、淋巴细胞计数（Lymph#）、单核细胞数（Mon#）、中性粒细胞计数（Gran#）、淋巴细胞百分比（Lymph%）、中性粒细胞百分比（Gran%）、单核细胞百分比（Mon%）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板计数（PLT）均与正常组相比无明显差异。血液生化指标:谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、总蛋白（TP）、血糖（GLU）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、和离子检测包括钠离子（Na+）、钾离子（K+）、氯离子（Cl-）与正常组相比均无明显统计学差异。尿液检查指标:尿常规、尿PH值、尿比重与正常组相比均无明显统计学差异。通过嗜多染红细胞微核试验检测骨髓状态,结果显示扶正膏并未对骨髓分化有影响。检测心、肝、肾、肺、脾、胸腺、肾上腺、睾丸（雄鼠）、子宫（雌鼠）等脏器的器官指数,扶正膏低、中、高剂量组与正常组相比均无明显统计学差异。给药各组HE结果显示,心脏:心肌纤维排列整齐,结构清晰;肾脏:肾小球血管袢薄而清晰,周围的肾小管结构完整,管腔清晰,基底膜完整,肾小管上皮细胞排列整齐,镜下未见空泡细胞形成,未见炎性细胞浸润;肝脏:肝细胞结构形态正常,无坏死及炎症细胞浸润;脾脏:脾脏组织形态正常,被膜、小梁、白髓和红髓结构清晰,脾小体未见增大,生发中心明显,脾窦内壁光滑,未见充血和淋巴细胞;肺脏:肺组织结构均正常,肺泡隔、肺泡腔完整,肺间质分布均匀。胸腺:胸腺被膜完整,皮质较厚,髓质边界清晰;肾上腺:网状带、束状带均增宽,细胞规则排列,结构清晰;睾丸:生精小管中精原细胞核大而圆,贴于基膜内,排列整齐,各级精母细胞层数清晰可见,近管腔侧可见大量精子细胞,管腔内充满精子;子宫:子宫平滑肌细胞交错成束整齐排列,平滑肌细胞呈纺锤形,细胞核均匀分布;以上结果说明,扶正膏无毒性。2.扶正膏对免疫功能低下的影响结果显示与正常组相比,模型组的小鼠体重明显降低,脾指数和胸腺指数明显下降。HE结果显示:脾脏红髓和白髓混合,小梁被拆散或消失,脾窦扩张,脾脏淋巴细胞减少。胸腺皮质和髓质分界不清,皮质淋巴细胞分布稀疏,间隙增加;血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM、血清细胞因子IL-2、IFN-γ分泌均显著减少。脾脏中CD4+T细胞的比例显著降低。淋巴细胞转化率（细胞免疫功能）、抗体生成数（体液免疫功能）、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性均显著降低。通过扶正膏干预之后,体重、胸腺指数、脾指数均有所上升。HE结果显示脾脏:脾脏淋巴滤泡均出现不同程度的增多,红细胞渗出现象有所改善,脾窦不同程度的变窄,细胞损伤现象有所减轻。胸腺:胸腺组织皮质和髓质界限比较清晰,皮质淋巴细胞分布不同程度密集,间隙变窄。免疫球蛋白IgA、IgG、IgM及IL-2、IFN-γ分泌均有所增加。脾脏中CD4+T细胞的比例均显著升高。体液免疫功能、细胞免疫功能。单核—巨噬细胞功能。NK细胞活性均显著改善。3.扶正膏增强细胞免疫功能机制初探Western Blot结果显示与正常组比较,模型组脾脏组织中TLR4、MyD88、TFAF6、IRAK4的蛋白表量达均显著下调;经扶正膏干预后,各组小鼠脾脏组织中上述蛋白的蛋白表达量均显著逆转。体外分离、培养正常小鼠脾淋巴细胞,使用MyD88抑制剂ST2825和扶正膏含药血清体外干预后,与正常组相比,含药血清组TLR4、MyD88、TFAF6、IRAK4的蛋白表量达均显著上调,与正常组相比,抑制剂组的TLR4、MyD88、TFAF6、IRAK4的蛋白表量达水平明显降低。与抑制剂组相比,含药血清+抑制剂组的TLR4、MyD88、TFAF6、IRAK4的蛋白表量达无显著差异。ELISA检测经含药血清和MyD88抑制剂干预后的细胞上清液中IL-2、IFN-γ的表达量,表达趋势与体外培养淋巴细胞中蛋白表达的趋势一致。结论中药复方制剂扶正膏无毒性,且扶正膏具有良好的免疫增强作用,可能通过TLR4信号通路,提高细胞免疫功能。