论文部分内容阅读
目的:再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)和骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome, MDS)是常见的血液系统疾病。AA为骨髓造血衰竭、造血组织减少致血细胞减少,MDS则为造血干细胞克隆性异常致造血功能紊乱。MDS和AA是两种性质完全不同的疾病,两者的发病机制目前并不十分明确,治疗方案和预后也有很大差异,但两者临床表现却有许多相似,如全血细胞减少所致的贫血、出血和感染等,不典型病例二者鉴别非常困难,因为两者均无特异性诊断指标。MDS的诊断,尤其是对那些原始细胞比例增高不明显且无克隆性染色体异常的患者,基本上是排他性诊断。MDS约10%左右患者就诊时可表现为骨髓增生减低,约1/4患者无明显病态造血,仅有40%~70%存在细胞遗传学异常等[1],AA患者可表现为骨髓增生活跃,亦可出现病态造血,甚至有细胞遗传学异常。因此鉴别低增生性MDS和AA非常困难。近年国内外研究发现AA、MDS患者人类白细胞抗原DR15(human leukocyte antigen, HLA-DR15)的表达频率明显增高,且HLA-DR15阳性与免疫抑制治疗的反应有显著的相关性,阳性者对环抱素A(cyclosporine A,CsA)的治疗可有依赖性。另外,大多数学者认为AA主要发病机制为原发性/继发性造血干/祖细胞量或质异常及免疫机制的紊乱。而MDS疾病表现存在异质性,其疾病的本质就是造血干/祖细胞的恶性克隆增殖。CD34+是造血干/祖细胞的特征性标记,研究MDS及AA患者的骨髓细胞CD34+特征,对MDS及AA的诊断和鉴别诊断有一定的意义。近年来,CD4+ CD25+Treg细胞在免疫抑制中的作用受到重视,成为研究的热点,认为CD4+ CD25+Treg细胞可能参与了自身免疫疾病的发生,在AA和MDS的发病中起到一定的作用。还有研究发现,在一些恶性血液病,如白血病、MDS患者,有核红细胞中胎儿血红蛋白的水平增高,但在AA中表达不增高,可能对于鉴别AA和MDS有一定意义。本研究通过检测AA、MDS患者HLA-DRB1*1501的表达,并与正常对照组进行对比,以了解HLA-DRB1*1501在AA和MDS患者的表达特点;初步分析免疫抑制治疗对HLA-DRB1*1501阳性和阴性AA、MDS患者的疗效;同时应用流式细胞术(nowcytometry,FCM)检测AA和MDS患者CD34+、CD4+CD25+Treg细胞表达水平及胎儿血红蛋白的变化,以了解其在免疫发病机制中的作用;用免疫组化的方法检测骨髓中有核红细胞的表达;并追踪随访,进行治疗前后的对比。通过对多个指标的联合检测,达到指导临床鉴别及诊断的目的。方法: 1研究对象: 14例AA患者及20例MDS患者及30名健康者作为正常对照(normal control, NC)。其中AA患者14例,男8例、女6例,年龄范围14~66岁,中位年龄26岁,其中慢性再生障碍性贫血(CAA)9例、重型再生障碍性贫血(SAA)5例。MDS患者20例,男9例、女11例,年龄范围27~75岁,中位年龄58岁,按FAB分型,其中难治性贫血(RA)8例、原始细胞过多难治性贫血(RAEB) 12例。正常对照30例,均取自常规体检正常的人群,男女各15例,年龄范围20-75岁,中位年龄55岁。2研究方法:用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)进行HLA-DRB1*1501测定、用流式细胞分析技术检测CD34+、CD4+CD25+Treg及胎儿血红蛋白、用免疫组化方法测定胎儿血红蛋白的表达,并对14例AA患者追踪随访6个月,进行治疗前后的对比,收集患者基本临床资料进行分析。结果: 1 HLA-DRB1*1501检测1.1 HLA-DRB1*1501在AA患者组表达率为64.28%,在正常对照组的表达率为13.33%,AA患者组的表达水平明显高于对照组(P<0.01)。RR值为11.7,RR值>1。1.2 HLA-DRB1*1501在MDS患者组表达率为45.0%,与正常对照组相比明显高于对照组(P<0.01)。RR值为5.318,RR值>1。AA患者组的表达水平(64.28%)明显高于MDS患者组(45.0%),差异有统计学意义(P<0.01)。1.3对14例AA患者进行免疫抑制治疗,有效者有6例,占42.86%,其中6例全部为HLA-DR15阳性者,治疗有效率(6/9)为66.67%,阴性组0例,有效率为0。两组比较差别有统计学意义(P<0.05)。2 CD34+在各组中的表达2.1 AA组者CD34+细胞占骨髓单个核细胞的比例为(0.224±0.106),明显低于正常对照组(1.183±0.468)、MDS-RA组(0.753±0.295)及MDS- RAEB组(3.760±1.228),差异有显著意义。2.2 RA组(0.753±0.295)CD34+细胞占骨髓单个核细胞的比例明显低于RAEB组(3.760±1.228)(P<0.01);RAEB组(3.760±1.228)CD34+细胞比例明显高于RA(0.753±0.295)以及正常对照组(1.183±0.468)(P<0.01);2.3对14例AA组患者进行CsA治疗6个月后,骨髓中CD34+细胞比例(0.701±0.286)与治疗前比较,高于治疗前(0.224±0.106)。3 CD4+CD25+Treg细胞的表达3.1 AA患者骨髓中CD4+CD25+Treg细胞比例(6.00±1.47)明显低于正常对照组(8.52±1.50)及MDS-RAEB组(10.19±1.54),与MDS-RA(6.45±1.26)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。3.2 MDS-RA、MDS-RAEB组骨髓中CD4+CD25+Treg细胞比例逐渐增高;RA组(6.45±1.26)CD4+CD25+Treg细胞比例明显低于RAEB(10.19±1.54)及正常对照组(8.52±1.50)(P均<0.01);RAEB组(10.19±1.54)CD4+ CD25+Treg细胞比例明显高于RA以及正常对照组(P均<0.01);3.3应用CsA治疗后,AA患者(7.12±2.78)骨髓中CD4+CD25+Treg细胞比例明显高于治疗前(6.00±1.47)。4胎儿血红蛋白的表达4.1 AA患者组胎儿血红蛋白表达(54.993±8.775)明显高于对照组(48.190±7.978),差异有统计学意义(P< 0. 05)。MDS患者组胎儿血红蛋白表达(62.140±10.409)显著高于对照组(48.190±7.978)及AA患者(54.993±8.775),差异有显著意义(P < 0. 05)。4.2免疫组化检测胎儿血红蛋白20例MDS中,胎儿血红蛋白阳性的有11例,其中,RA8例,6例表达阳性。RAEB12例,5例表达阳性。14例AA患者中,免疫组化阳性的只有2例。5 14例AA中,CD34+的表达均是减低的,HbF阳性者有2例。8例MDS- RA中,CD34+和HbF均是阳性的有4例,CD34+和HbF均是阴性的有1例,只有CD34+阳性的有1例,只有HbF阳性的有2例。12例MDS-RAEB中,CD34+和HbF均是阳性的有4例,CD34+和HbF均是阴性的有2例,只有CD34+阳性的有5例,只有HbF阳性的有1例。结论:1 HLA-DRB1*1501在AA、MDS患者中表达高于正常对照组,有统计学差异。AA、MDS组RR值均>1,说明疾病与HLA-DRB1*1501呈“正”关联,RR值越大表明关联强度越强,AA与HLA-DR15的关联强度最强, HLA-DRB1*1501是AA和MDS的易感基因。提示HLA-DRB1*1501在AA和MDS的鉴别方面可能存在一定的价值。2 AA患者骨髓CD34+含量较正常对照明显减少( P < 0.01) ,具有显著性差异。这可能表明AA致病因素与骨髓造血干细胞/祖细胞缺陷有关。MDS-RA组CD34+含量与正常对照无明显差异,MDS-RAEB组CD34+含量较正常对照明显增高,提示MDS-RAEB异常克隆发生于造血干/祖细胞。MDS - RA组与MDS- RAEB组比较,差异也有统计学意义,考虑CD34+与疾病的进展和预后有关。3 AA患者CD4+CD25+Treg细胞比例明显低于正常对照组,提示AA患者存在明显的免疫调控异常,可能与AA的发生、发展有密切的关系;MDS患者CD4+CD25+Treg细胞比例随预后危险级别的升高而升高,提示免疫异常是MDS疾病的发生、发展的一个促进因素。但MDS患者的免疫状态存在异质性,明确免疫因素在MDS疾病发病机理中的确切作用还有待进一步地研究。4.用免疫组化及流式细胞分析技术的方法都证明MDS患者胎儿血红蛋白水平显著高于AA患者,推测在血液病的发病中,胎儿血红蛋白发生了变化,可以作为鉴别AA和MDS的一个新的指标。5联合CD34+和HbF两个指标鉴别MDS-RA和AA,诊断率明显提高。6对14例AA患者进行追踪随访,规律服用CsA免疫抑制治疗。测其治疗后的各项指标发现, HLA-DRB1*1501阳性组有效率高于阴性组,两组比较差别有统计学意义,提示HLA-DRB1*1501可能是CsA治疗有效的预测基因。另外,服用CsA免疫抑制治疗后,CD34+、CD4+CD25+Treg细胞较治疗前增加,进一步证明这几个指标在AA和MDS的鉴别诊断中存在一定意义。