【摘 要】
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该研究应用DNAsis version 2.5对猪繁殖—呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(HCV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪流感病毒(SIV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)等6种引起
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该研究应用DNAsis version 2.5对猪繁殖—呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(HCV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪流感病毒(SIV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)等6种引起猪繁殖障碍的重要病毒基因组部分序列进行同源性分析,确定保守区域.根据PRRSVMN基因、HCVE2基因、JEV多聚蛋白基因、SIV M基因、PRV gD和PPV NS-1基因保守区分别设计20对引物,并按多联PCR引物设计要求,确定其中6对作为多联PCR引物.六种病毒PCR/RT-PCR扩增产物大小分别为:PRRSV北美型660bp,欧洲型637bp;HCV 390bp;JEV 485bp;SIV315bp;PRV 217bp;PPV 330bp.在确立其PCR特异性、敏感性的同时,探讨了常规酚-氯仿抽提与快速抽提法抽提病料DNA的方法,并对其PCR检测敏感性进行对比测定.通过相关PCR/RT-PCR程序设计,优化PCR/RT-PCR检测的各项反应因素:反转录引物、退火温度、引物浓度、Mg<2+>浓度、缓冲液等,建立6种病毒单项PCR/RT-PCR检测方法,其检测敏感度为:PRRSV 74.5TCID<,50>;SIV 13.9 EID<,50>;HCV 10<-5>稀释cDNA;JEV 10<-4>稀释cDNA;PPV 3.2TCID<,50>;PRV 100.2 TCID<,50>.对扩增产物进行测序鉴定,证明PCR扩增的特异性.应用所建立的各病毒的PCR/RT-PCR方法和程序,对疑似猪病毒性繁殖障碍的送检病料进行检测,配合临床症状、病理变化和流行病学分析,确立了PCR/RT-PCR单项检测方法应用可行性,其结果如下:PRRSV25/88;SIV 6/25;HCV 8/38;JEV 1/17;PPV 10/29;PRV 12/52.在优化单项PCR/RT-PCR基础上,通过优化组合、确定合适引物浓度建立了PRRSV-PRV-SIV、JEV-PPV-HCV多联PCR诊断体系,并用于10例流产病料检测,结果如下:PRRSV 2/10;HCV 2/10;SIV2/10 JEV0/10;PPV6/10;PRV3/10;PRRSV3/10,与单项PCR/RT-PCR检测符合率为98.3%.比常规单项PCR/RT-PCR诊断方法更省时、节约诊断成本,为建立简便、敏感、特异、稳定的猪病毒性繁殖障碍分子生物学诊断试剂盒奠定了厚实的基础.
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