【摘 要】
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丝状真菌三孢布拉霉（Blakeslea trispora）是生产β-胡萝卜素（β-Carotene）的工业菌株,其β-胡萝卜素的合成受光照调控,由光受体蛋白Bt WC-1a、Bt WC-1b及Bt WC-1c介导,但该过程的分子机制尚不清楚。由于目前在三孢布拉霉中尚未建立高效的转化体系及遗传操作技术,制约了对包括上述问题在内的三孢布拉霉遗传学和分子生物学的研究。为了建立适用于三孢布拉霉的遗传操作工
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丝状真菌三孢布拉霉（Blakeslea trispora）是生产β-胡萝卜素（β-Carotene）的工业菌株,其β-胡萝卜素的合成受光照调控,由光受体蛋白Bt WC-1a、Bt WC-1b及Bt WC-1c介导,但该过程的分子机制尚不清楚。由于目前在三孢布拉霉中尚未建立高效的转化体系及遗传操作技术,制约了对包括上述问题在内的三孢布拉霉遗传学和分子生物学的研究。为了建立适用于三孢布拉霉的遗传操作工具,本研究进行了以下几个方面的研究。1)建立并优化了电击转化三孢布拉霉原生质体的方法。首先确定了适用于三孢布拉霉原生质体制备的最佳酶解时间,接着对不同电场强度、核酸浓度、电转缓冲液及再生时间进行了单因素实验,分别确定了它们的最佳条件。此外,针对较为显著的四个因素,设置了四个水平正交实验。最终确定了三孢布拉霉电击转化原生质体的最适条件为:酶解3 h、电压0.4 kv、电脉冲2 ms、核酸质量浓度2.5μg·m L-1和再生时间3 h。2)基于CRISPR/Cas9技术探究了适用于三孢布拉霉的基因编辑体系。选用三孢布拉霉的组蛋白H2B预估的核定位信号HTBNLS作为Cas9蛋白的核定位信号,将内源的Bt5S r RNA或预测的Bt U6启动子作为sg RNA表达的启动子。构建了p UC57/p DHt/sk-Bt Cas9-Bt HTBNLS-Bt U6/Bt5S r RNA-sg RNA-hph（btwc-1c-target1/2/3）质粒并分别转化至三孢布拉霉中。后续通过电击转化原生质体的方法将含有新霉素基因neo及btwc-1c同源臂的供体质粒导入已摄取了质粒p DHt/sk-Bt Cas9-Bt HTBNLS-Bt U6/Bt5S r RNA-sg RNA-hph（btwc-1c-target1/2/3）的三孢布拉霉中。然而,基于构建的该基因编辑系统未能有效筛选到阳性克隆。为了能更加有效地筛选到阳性转化子,选择了表型颜色变化更明显的基因car B作为靶基因。基于电击转化原生质体的方法将磷酸化与硫代磷酸化修饰的m Cherry红色荧光蛋白基因导入已整合cas9及sg RNA表达框的三孢布拉霉中。虽经过大量的传代、筛选与测序分析,依然未获得靶基因敲除菌株,可能与菌株遗传背景复杂相关。3)为了解决遗传操作限制的问题,可以采用转录后水平的基因沉默技术,即RNA干扰技术对靶基因进行表达调控。基于该技术靶向btwc-1a、btwc-1b及btwc-1c构建了RNA干扰菌株,对其调控β-胡萝卜素合成进行了分析。通过构建p Cambia1303-m U6-btwc-1a、p Cambia1303-m U6-btwc-1b与p Cambia1303-m U6-btwc-1c质粒,分别转化至三孢布拉霉中,基于荧光定量PCR技术对这三个靶基因的转录水平进行了分析,结果表明btwc-1a、btwc-1b及btwc-1c的相对转录水平相对于对照菌株分别降低了72%、67%和63%,因此构建的RNA干扰技术可以应用于三孢布拉霉的分子生物学研究。4)基于RNA干扰技术对光受体Bt WC-1s影响β-胡萝卜素合成进行了分析。在全黑暗条件下培养时,靶向btwc-1a、btwc-1b及btwc-1c的RNA干扰菌株与对照菌株相比β-胡萝卜素合成并无显著差异。在蓝光照射后,与对照菌株相比,btwc-1a和btwc-1c RNA干扰菌株合成β-胡萝卜素存在显著差异,其β-胡萝卜素含量最高分别降低了1%与36%,而btwc-1b RNA干扰菌株无显著差异,表明光照诱导β-胡萝卜素的合成主要与btwc-1a和btwc-1c相关,与btwc-1b无关。随后分析了靶向btwc-1a与btwc-1c的RNA干扰菌株中β-胡萝卜素结构基因car B与car RA的相对转录水平。与对照菌株相比,btwc-1a与btwc-1c RNA干扰菌株car B及car RA基因相对转录水平明显较低,表明btwc-1a及btwc-1c影响β-胡萝卜素的合成与其调控β-胡萝卜素结构基因的表达成正相关。
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