黄瓜谷氧还蛋白CsGRX基因家族的克隆、表达分析及功能的初步研究

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谷氧还蛋白是一类小分子的热稳定氧化还原蛋白,能调节蛋白质的可逆氧化还原反应,在植物体抗生物胁迫和非生物胁迫中发挥重要的作用。目前,谷氧还蛋白在黄瓜中的研究未有报道。本研究首先克隆到首个黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX1(根据拟南芥AtGRX480的电子克隆序列),在此基础上,同源克隆CsGRX的家族成员,并对其进行生物信息学分析;进行了CsGRX1基因的亚细胞定位;分析了CsGRXs基因在黄瓜不同组织器官中的表达模式;通过拟南芥叶肉原生质体瞬时表达体系初步研究了 CsGRXs基因功能;并通过酵母双杂实验分析了 CsGRXs家族成员与拟南芥TGA转录因子的相互作用,为黄瓜CsGRX基因功能的进一步研究奠定了理论基础。主要结果如下:1.克隆了 8个黄瓜CsGRXs基因,生物信息学分析表明,7个属于CC型GRX,1个属于CPYC型GRX。对其基因组DNA序列分析表明,CsGRX1无内含子。CC型CsGRXs都含有CCMC/S结构域Ⅰ、CsGRX1的G105甘氨酸残基结构Ⅱ、L**LL结构域Ⅲ及C末端AL/IWL/V结构域Ⅳ。CsGIX1和CsGRX6与AtGRXC9(GRX480)的同源性较低,CsGRX4相CsGRX7与水稻及拟南芥的ROXY1和ROXY2同源性较可达70%。2.CsGRX1在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位表明,其初步定位于细胞质中。3.黄瓜CsGRXs基因在黄瓜不同组织部位、果实发育过程及花中的Real-time PCR分析表明,CsGRXs基因在黄瓜不同组织部位及生长发育阶段表达不同,CC型CsGRXs基因在花中的表达明显高于其他组织器官,而CsGRX5在花中的相对表达量最高。在黄瓜不同组织部位中,CC型CsGRXs在根中的表达量最高,其中,CsGRX5和CsGRX8基因在各组织部位中的表达水平均高于其他基因。随着叶片的成熟衰老CsGRXs基因表达量呈上升趋势,老叶中表达量较高。CsGRX1基因在黄瓜幼嫩雄花的萼片中表达量较高,随着花发育成熟,花蕊和花瓣中的表达量增高。4.黄瓜CsGRXs基因在拟南芥原生质体中的暂态表达体系分析表明,CPYC型的CsGRX2不能抑制LUC酶活性;而具有ALWL结构域的CC型CsGRX家族成员可抑制LUC酶活性:具有ALWV结构域的CC型CsGRX家族成员不能抑制LUC酶活性。5.通过酵母双杂实验对黄瓜CsGRXs蛋白与拟南芥的TGA转录因子的互作分析表明,CC型CsGRX家族成员与拟南芥TGA转录因子都可以相互作用,而CPYC型CsGRX2与拟南芥TGA转录因子不能相互作用。
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