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水稻作为世界上最重要的主粮作物，为全球超过50%的人口提供能量来源。但是由子囊真菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病及黄单胞杆菌Xanthomonas oryzae引起的白叶枯病严重威胁着水稻的安全生产。主效抗病基因编码的NBS-LRR蛋白在病原菌侵染诱导的免疫应答中扮演着信息传递的中间受体，直接识别病原菌分泌的无毒蛋白后激活下游防卫反应。水稻抗病基因调控的复杂网络涉及多层次的生理生化反应，深入探究抗性基因具体调节的免疫分子通路，不仅有助于揭示植物与病原菌之间的互作机制，还能为聚合多基因开展水稻抗病育种提供理论指导。
本研究对水稻广谱、高抗稻瘟病株系H4中的抗性基因Pik-H4介导的稻瘟病抗性进行深入解析，Pik-H4编码的NBS-RR蛋白识别稻瘟病菌无毒蛋白AvrPik后激活ETI免疫反应。前期利用酵母双杂交筛选、转录组测序及差异蛋白质组 ITRAQ测序已鉴定出 Pik-H4潜在的抗病途径。本研究发现 Pik-H4与细胞核转录因子 OsBIHD1、OsCOL9相互作用于转录水平调节激素交互途径影响抗病与生长。除转录调控外， Pik-H4通过下调细胞质蛋白OsAAE3的mRNA水平抑制由木质素缺失导致的稻瘟病抗性降低及生长发育异常。同时，Pik-H4激活的免疫信号通路兼具白叶枯抗性，在Pik-H4近等基因系材料中受稻瘟病菌侵染后上调表达的OsPrx30依赖ROS信号途径，负向调控细菌性白叶枯抗病性。主要结论如下：
1、稻瘟病抗性基因 Pik-H4由 Pik1-H4和 Pik2-H4组成， Pik1-H4编码的CC-NBS-LRR蛋白的螺旋卷曲结构域与同源异形盒转录因子OsBIHD1的HD结构域在细胞核内发生相互作用。在Pik-H4近等基因系中敲除OsBIHD1导致植株稻瘟病抗性丧失，OsBIHD1-OX植株中病程相关基因PR1b和乙烯合成途径关键基因的OsACO3表达量显著上升，OsBIHD1的表达水平受到外源乙烯合成前体ACC的诱导，OsBIHD1直接结合OsACO3启动子区内的顺式作用元件TGTCA，通过调控乙烯合成途径增强稻瘟病抗性。但是OsBIHD1-OX植株严重矮化，转基因植株中油菜素合成基因表达显著降低，油菜素信号传导基因表达紊乱。OsBIHD1的过表达植株对外源油菜素不敏感，且油菜素代谢基因CYP734A2、CYP734A4、CYP734A6表达量显著增加，OsBIHD1通过结合CYP734A2启动子TGTCA元件促进油菜素失活，抑制植株生长。研究结果表明OsBIHD1是Pik-H4调节稻瘟病抗性必须的下游因子，OsBIHD1作为重要的分子开关利用油菜素乙烯交互途径调节稻瘟病抗性及植株生长。
2、Pik-H4与CONSTANS-Like9（OsCOL9）在酵母细胞中产生相互作用。OsCOL9属于水稻COL II家族蛋白，编码具有转录激活特性的转录因子。OsCOL9表达量受稻瘟病菌诱导，在叶片中最高，在Pik-H4 NIL中敲除OsCOL9导致植株感病，且病程相关基因表达量（PR1a、PR1b、PR10）显著下调。OsCOL9转录受到外源水杨酸与乙烯前体ACC的诱导，水杨酸调控基因NPR1、WRKY45和乙烯合成中的ACO家族基因表达在OsCOL9-OX株系中显著增加，表明OsCOL9参与调控水杨酸及乙烯抗稻瘟病反应。此外，OsCOL9与受体蛋白类似激酶OsRACK1在细胞核内相互作用，并且 OsRACK1的表达量同样受到稻瘟病菌、水杨酸和乙烯前体 ACC的诱导。OsCOL9-OX中OsRACK1表达量升高，OsCOL9及OsRACK1的表达量受光周期诱导的昼夜节律调控
3、Pik-H4与AMP-binding结构域包含蛋白OsAAE3在酵母细胞中产生相互作用。OsAAE3与其拟南芥中的4CL-like10最为相似，定位于细胞质区域，启动子活性分析表明OsAAE3启动子在所有的水稻组织中均能激活 GUS表达，且在叶片中表达量最高。OsAAE3-OX植株表现出稻瘟病抗性降低，敲除植株并不显著影响植株抗病性。该现象主要归因于末端的病程相关基因PR1a的表达量显著降低，过氧化物酶活性降低，且过氧化物酶前体编码基因表达量减少，但 ROS含量上升并触发细胞程序性死亡。OsAAE3过表达负向调控植株幼穗小花发育、造成小花外稃扭曲、花粉育性降低。此外，OsAAE3负向调控木质素合成相关基因的表达，导致植株总体木质素含量降低，植株严重矮化。
4、前期在Pik-H4响应早期稻瘟病菌侵染的差异基因及差异蛋白质表达谱中鉴定到植物第III类过氧化物酶（Class III PRXs）基因OsPrx30表达量在抗感材料中具有差异，该基因也能够被白叶枯菌X.oryzae诱导。GUS活性分析及组织表达量检测表明OsPrx30主要在叶片、根及茎中表达，OsPrx30蛋白定位于内质网、过氧化物酶体、细胞膜。OsPrx30-OX植株过氧化物酶活性增强，POD过度清除抗菌物质H2O2，白叶枯感病性增加。此外，AT-hook蛋白OsATH1结合OsPrx30启动子区域内AT-rich序列，敲除 OsATH1接种白叶枯病症与过表达 OsPrx30相似，转录组测序分析显示敲除OsATH1导致OsPrx30表达量升高，OsATH1增加OsPrx30染色质组蛋白乙酰化促进OsPrx30转录。
综上所述，本研究对Pik-H4调控的抗病通路进行了全面解析，发现Pik-H4调节宿主ETI反应与植物生长间的分子开关，与AMP结合蛋白协同作用调节细胞壁成分木质素的合成，利用AT-hook及CⅢ PRX蛋白影响抵御真菌-细菌共有的ROS信号途径。本研究不仅为NBS-LRR类抗病蛋白调控的抗病分子机理奠定了基础，同时也为运用抗病基因开展多基因聚合育种提供理论指导。
本研究对水稻广谱、高抗稻瘟病株系H4中的抗性基因Pik-H4介导的稻瘟病抗性进行深入解析，Pik-H4编码的NBS-RR蛋白识别稻瘟病菌无毒蛋白AvrPik后激活ETI免疫反应。前期利用酵母双杂交筛选、转录组测序及差异蛋白质组 ITRAQ测序已鉴定出 Pik-H4潜在的抗病途径。本研究发现 Pik-H4与细胞核转录因子 OsBIHD1、OsCOL9相互作用于转录水平调节激素交互途径影响抗病与生长。除转录调控外， Pik-H4通过下调细胞质蛋白OsAAE3的mRNA水平抑制由木质素缺失导致的稻瘟病抗性降低及生长发育异常。同时，Pik-H4激活的免疫信号通路兼具白叶枯抗性，在Pik-H4近等基因系材料中受稻瘟病菌侵染后上调表达的OsPrx30依赖ROS信号途径，负向调控细菌性白叶枯抗病性。主要结论如下：
1、稻瘟病抗性基因 Pik-H4由 Pik1-H4和 Pik2-H4组成， Pik1-H4编码的CC-NBS-LRR蛋白的螺旋卷曲结构域与同源异形盒转录因子OsBIHD1的HD结构域在细胞核内发生相互作用。在Pik-H4近等基因系中敲除OsBIHD1导致植株稻瘟病抗性丧失，OsBIHD1-OX植株中病程相关基因PR1b和乙烯合成途径关键基因的OsACO3表达量显著上升，OsBIHD1的表达水平受到外源乙烯合成前体ACC的诱导，OsBIHD1直接结合OsACO3启动子区内的顺式作用元件TGTCA，通过调控乙烯合成途径增强稻瘟病抗性。但是OsBIHD1-OX植株严重矮化，转基因植株中油菜素合成基因表达显著降低，油菜素信号传导基因表达紊乱。OsBIHD1的过表达植株对外源油菜素不敏感，且油菜素代谢基因CYP734A2、CYP734A4、CYP734A6表达量显著增加，OsBIHD1通过结合CYP734A2启动子TGTCA元件促进油菜素失活，抑制植株生长。研究结果表明OsBIHD1是Pik-H4调节稻瘟病抗性必须的下游因子，OsBIHD1作为重要的分子开关利用油菜素乙烯交互途径调节稻瘟病抗性及植株生长。
2、Pik-H4与CONSTANS-Like9（OsCOL9）在酵母细胞中产生相互作用。OsCOL9属于水稻COL II家族蛋白，编码具有转录激活特性的转录因子。OsCOL9表达量受稻瘟病菌诱导，在叶片中最高，在Pik-H4 NIL中敲除OsCOL9导致植株感病，且病程相关基因表达量（PR1a、PR1b、PR10）显著下调。OsCOL9转录受到外源水杨酸与乙烯前体ACC的诱导，水杨酸调控基因NPR1、WRKY45和乙烯合成中的ACO家族基因表达在OsCOL9-OX株系中显著增加，表明OsCOL9参与调控水杨酸及乙烯抗稻瘟病反应。此外，OsCOL9与受体蛋白类似激酶OsRACK1在细胞核内相互作用，并且 OsRACK1的表达量同样受到稻瘟病菌、水杨酸和乙烯前体 ACC的诱导。OsCOL9-OX中OsRACK1表达量升高，OsCOL9及OsRACK1的表达量受光周期诱导的昼夜节律调控
3、Pik-H4与AMP-binding结构域包含蛋白OsAAE3在酵母细胞中产生相互作用。OsAAE3与其拟南芥中的4CL-like10最为相似，定位于细胞质区域，启动子活性分析表明OsAAE3启动子在所有的水稻组织中均能激活 GUS表达，且在叶片中表达量最高。OsAAE3-OX植株表现出稻瘟病抗性降低，敲除植株并不显著影响植株抗病性。该现象主要归因于末端的病程相关基因PR1a的表达量显著降低，过氧化物酶活性降低，且过氧化物酶前体编码基因表达量减少，但 ROS含量上升并触发细胞程序性死亡。OsAAE3过表达负向调控植株幼穗小花发育、造成小花外稃扭曲、花粉育性降低。此外，OsAAE3负向调控木质素合成相关基因的表达，导致植株总体木质素含量降低，植株严重矮化。
4、前期在Pik-H4响应早期稻瘟病菌侵染的差异基因及差异蛋白质表达谱中鉴定到植物第III类过氧化物酶（Class III PRXs）基因OsPrx30表达量在抗感材料中具有差异，该基因也能够被白叶枯菌X.oryzae诱导。GUS活性分析及组织表达量检测表明OsPrx30主要在叶片、根及茎中表达，OsPrx30蛋白定位于内质网、过氧化物酶体、细胞膜。OsPrx30-OX植株过氧化物酶活性增强，POD过度清除抗菌物质H2O2，白叶枯感病性增加。此外，AT-hook蛋白OsATH1结合OsPrx30启动子区域内AT-rich序列，敲除 OsATH1接种白叶枯病症与过表达 OsPrx30相似，转录组测序分析显示敲除OsATH1导致OsPrx30表达量升高，OsATH1增加OsPrx30染色质组蛋白乙酰化促进OsPrx30转录。
综上所述，本研究对Pik-H4调控的抗病通路进行了全面解析，发现Pik-H4调节宿主ETI反应与植物生长间的分子开关，与AMP结合蛋白协同作用调节细胞壁成分木质素的合成，利用AT-hook及CⅢ PRX蛋白影响抵御真菌-细菌共有的ROS信号途径。本研究不仅为NBS-LRR类抗病蛋白调控的抗病分子机理奠定了基础，同时也为运用抗病基因开展多基因聚合育种提供理论指导。