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流感是由正粘病毒科的流感病毒所引起的一种传染性疾病。它能够在全世界范围内广泛传播并在多种宿主中引起大规模的感染,造成了极大的疫情和经济损失。由于流感病毒的高突变率及病毒重排所带来的变异,现今流感治疗及疫苗研发最重要的是设计能够有效地引起机体产生广谱且持续的中和抗体反应的免疫原,以便能够预防和保护已知的和将到来的未知的流感病毒感染。 高致病性禽流感病毒H5N1自1996年在中国出现以来,造成了超过5亿家禽感染,至今已有八百多人感染H5N1禽流感病毒,致死率将近60%。家禽感染后引起的巨大经济损失,在人类中极高的致死率和其造成下一次流感大流行的可能性引起了极大的公众关注和恐慌。 实验室之前从感染高致病性禽流感H5N1的康复期病人记忆B细胞中分离到三株人源中和性单克隆抗体65C6、100F4和3C11,发现其中两株抗体65C6和100F4能够广谱且高效的中和除7.2亚型中某些毒株以外的所有H5N1病毒,并解析了其中一株65C6的中和表位。 在本论文中,我们首先研究了另一株抗体100F4的体外及体内中和能力,发现它是一株高效的广谱中和抗体,在小鼠体内实验中有很好的预防及治疗作用,对于H5N1高致病性禽流感的临床治疗有着非常良好的应用前景。 其次,我们通过酵母展示筛选出影响抗体100F4结合的HA上的氨基酸位点,再由假病毒中和实验和逃逸株筛选实验来验证表位,成功解析了100F4的中和表位。我们进一步解出了抗体100F4 Fab片段与HA蛋白头部的共结晶结构,更加精确得描述了抗体与抗原的结合方式。我们发现100F4的表位位于HA蛋白的头部受体结合位点以外的区域,为21个不连续的氨基酸组成,包含有我们之前鉴定出的D68和E112关键氨基酸位点。它是一个新的,在H5N1病毒中高度保守的中和表位。抗体100F4的轻重链共6个互补决定区CDR均与HA蛋白有相互作用,它能与HA上的关键位点如D68与E112间形成氢键,一旦此氢键被破坏,就会极大得影响抗体与抗原的结合,这更进一步验证了我们之前的功能实验中所得表位的准确性。 我们同时也解析了抗体65C6的Fab片段与HA蛋白头部的共结晶结构,发现其同样位于HA头部受体结合位点以外,但与受体结合位点非常靠近,较100F4的表位更靠近HA的顶端。它由18个氨基酸组成,包含有我们在之前的工作中鉴定得到的关键氨基酸残基P118,S121,K161,R162,Y164,T167,并且在H5N1中高度保守。65C6主要通过重链尤其是HCDR3与HA蛋白互作,并在关键位点如与P118,K161,R162,Y164,T167位置形成分子键、氢键、盐桥等多种分子相互作用。 由于100F4和65C6的抗体表位是新的表位,且位于受体结合位点以外,我们又进一步研究了抗体100F4与65C6的中和机制。我们发现无论病毒与细胞上的受体结合之前还是之后,抗体均可以与病毒相结合,并可以随着病毒一起被内吞进入细胞直至细胞的核外周区域。抗体100F4主要通过抑制HA介导的低pH诱导的膜融合过程来抑制病毒感染,而抗体65C6不仅能够部分的抑制病毒与细胞受体的结合,其主要的功能同样是抑制膜融合过程。抗体100F4与65C6的表位在HA1头部,却通过抑制HA2部分介导的膜融合过程来发挥作用,这是一个全新的中和机制。 在对100F4的逃逸株病毒的研究中,我们发现逃逸株病毒ES不可以被抗体100F4中和,在小鼠体内保护实验中也不能被100F4保护。然而抗体100F4却仍能够识别并结合逃逸株病毒ES,并与其一同进入细胞直至核外周区域。基于这些现象,我们对病毒的逃逸机制做了一些初步的探讨。我们发现100F4虽然能够与ES病毒结合,却不能够阻止ES的HA蛋白所介导的低pH诱导的膜融合过程。进一步研究发现100F4对ES的HA蛋白的亲和力比对野生型HA的亲和力低。我们推测100F4与逃逸株病毒ES及野生株SZ的HA蛋白的亲和力差异可能导致了其不能够阻止逃逸株ES的HA构象发生变化释放出融合肽,从而不能阻止后续的膜融合过程。 这些发现进一步完善了我们对流感抗体中和机制的理解,抗体100F4和65C6的广谱中和表位对于流感广谱疫苗的研发有一定的指导意义。