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近年来由珊瑚白化现象导致的珊瑚生态系统失衡问题越来越严重,为了探究珊瑚本身对环境氧化胁迫的响应机制,本研究克隆得到了稀杯盔形珊瑚两种抗氧化相关蛋白(铁蛋白和铜锌超氧化物歧化酶)的基因cDNA全序列,对编码的目的蛋白进行生物信息学分析,并在体外原核表达成功。主要研究结果如下: 1.铁蛋白基因研究结果 (1)铁蛋白基因cDNA全序列的克隆及序列分析 利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增法(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)克隆获得了稀杯盔形珊瑚铁蛋白(Ferritin)的基因cDNA全序列,其长度为906 bp,5非编译区(5UTR)为130 bp,3非编译区(3UTR)为257 bp,开放阅读框(ORF)长度为519 bp,编码172个氨基酸。Ferritin基因的5UTR含有一个铁反应元件(IRE)CAGTGA,3UTR含有一个加尾信号序列ATTAAA,末端具有polyA尾巴。预测编码的Ferritin氨基酸序列的分子量(Mw)为20.0 kDa,理论等电点(pI)为5.00。该蛋白具有脊椎动物铁蛋白H亚基保守的特征结构域,即一个铁氧化酶中心(Tyr26,Tyr29,Tyr31)和一个铁核形成位点(Glu59,His62),推测其同时具有H亚基和L亚基特性。预测氨基酸序列并未发现信号肽,也未预测到可能的跨膜结构;位于细胞质、线粒体和细胞核中的可能性分别为73.9％、8.7%和8.7%,而在其他细胞器中的可能性更小,证明Ferritin合成后定位在细胞质。 (2)铁蛋白基因的原核表达 Ferritin基因ORF与表达载体pET-28a连接构建得到原核表达载体,IPTG终浓度为1 mM、37℃诱导4h,在BL21(DE3)大肠杆菌中得到大量表达。 2.铜锌超氧化物歧化酶基因研究结果 (1)铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及序列分析 克隆获得的稀杯盔形珊瑚的铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)基因 cDNA全序列为730 bp,5UTR为111 bp,3UTR为188 bp,ORF为471 bp,编码156个氨基酸。3UTR存在加尾信号碱基序列AATAAA,末端具有polyA尾巴。预测编码的CuZnSOD氨基酸序列Mw为16.2 kDa,理论pI为6.11。该蛋白序列中含有2个CuZnSOD蛋白家族信号,一个是47-57位的氨基酸(GFHVHQFGDGT),另一个是141-152位的氨基酸(GNAGARFACGVI),包含4个 Cu2+结合位点(His49,His51,His66,His123)和4个Zn2+结合位点(His66、His74、His83,Asp86),Cu2+和Zn2+共同结合His66构成一个“咪唑桥”,与Cys60和Cys149之间形成的唯一的链内二硫键共同维持蛋白酶的稳定结构。预测氨基酸序列的Mw为16.2 kDa,与胞内CuZnSOD的平均Mw(16.0 kDa)极为接近;未预测到信号肽和跨膜结构,而且位于细胞质的可能性最大(56.5%),其次是线粒体和细胞核(均为13.0%),在其它细胞器的可能性更小;氨基酸序列NJ系统进化树显示,稀杯盔形珊瑚CuZnSOD与沟迎风海葵的胞内CuZnSOD的亲缘关系更接近。因此认为本研究获得的CuZnSOD为胞内CuZnSOD。 (2)铜锌超氧化物歧化酶基因的原核表达 选用pET-28a作为表达载体,在体外成功构建了稀杯盔形珊瑚CuZnSOD基因的重组质粒,IPTG终浓度为1 mM、37℃诱导4h,在BL21(DE3)大肠杆菌中得到大量表达。