食管癌是一种高侵袭性的肿瘤，世界范围内，食管癌患者死亡率占肿瘤患者死亡率的第六位，我国是食管癌的高发国家，河南省是高发省份。随着治疗手段的发展，食管癌的预后有所改善，但是其五年生存率仍然不容乐观。浸润转移是引起食管癌患者死亡的主要原因，因此，对食管癌浸润转移机制的探讨已成为研究热点之一。近来研究发现，在多细胞生物胚胎发育过程中的胚层和组织重建中存在一种现象：上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。最近研究认为它不仅存在于多细胞生物的胚胎发生过程中，同时也存在于多种慢性疾病以及肿瘤的进展过程中。Thiery这样描述上皮性肿瘤发生发展过程中的EMT：正常上皮细胞沿基底膜生长，通过表型遗传学的改变或基因突变，细胞发生转化生成原位癌(此时基底膜仍然保持完整)；继续发展，癌细胞通过EMT形式局部扩散，基底膜变脆，细胞侵入淋巴管和血管，发生转移；在种植部位，癌细胞还可通过间质-上皮转化形成转移瘤。上皮细胞发生EMT，以间质特性获得、上皮细胞极性丧失及运动能力增强为主要特征。这些特点与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移密切相关。目前关于食管鳞癌中是否存在EMT及EMT在食管鳞癌浸润转移中的作用尚未见报道。EMT是一个极其复杂的过程，包括：(1)细胞间连接(黏附连接、紧密连接、桥粒连接)解体，细胞分散；(2)细胞骨架重排，形成细胞-基质黏附，细胞运动能力增强。(3)细胞基因型的改变：在EMT过程中表达上调的因子主要包括间叶细胞标志物如纤维连接蛋白(fibronectin)、波形蛋白(Vimentin)、神经钙黏素(N-cadherin)等，以及诱导EMT的细胞因子和转录调节因子，如snail、slug，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)；还有对诱导EMT有辅助作用的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等。在EMT过程中表达下调的因子主要包括上皮细胞的标志物如上皮钙黏素(E-cadherin)，β-连环素(β-catenin)，γ-连环素(γ-catenin)，细胞角蛋白18(cytokeratin18)等。已有研究发现TGF-β在诱发EMT中起关键作用。有关食管鳞癌中是否存在EMT以及食管鳞癌中TGF-β1引发的EMT是否与食管癌的浸润转移有关，目前尚未见报道。本研究探讨了食管癌组织及食管鳞癌细胞系EC9706中TGF-β1的表达及其与E-cadherin及Vimentin的关系；采用针对TGF-β1的反义寡核苷酸干扰技术，抑制食管鳞癌细胞EC9706中TGF-β1的转录活性，探讨抑制TGF-β1对E-cadherin及Vimentin表达的影响，观察转染反义寡核苷酸对细胞形态学的影响及对细胞运动能力的影响，从而探讨食管鳞癌细胞中TGF-β1诱导的EMT；并探讨TGF-β1对食管鳞癌细胞EC9706增殖及凋亡的影响。探讨食管鳞癌浸润转移的分子机制，为食管癌浸润转移的阻断治疗提供理论基础。材料和方法1．采用免疫组织化学技术检测了100例手术切除的食管鳞癌组织及其癌旁“正常”粘膜中TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表达情况。2．采用RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术对食管鳞癌细胞系EC9706中的TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白及mRNA表达进行了检测。3．针对TGF-β1第一启动子的核苷酸片段设计合成反义寡核苷酸(ASODN)，采用阳离子聚合物瞬时转染培养的人食管鳞癌EC9706细胞。①观察TGFβ1-ASODN转染后细胞形态学的变化。②采用RT-PCR、免疫细胞化学方法、流式细胞术方法观察TGFβ1-ASODN转染后细胞中TGF-β1mRNA及蛋白表达的变化。③采用RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术方法观察TGFβ1-ASODN转染后细胞中E-cadherine与Vimentin mRNA及蛋白表达的变化。④采用细胞划痕试验检测TGFβ1-ASODN转染后细胞迁移能力的变化。4．采用流式细胞术、MTT观察转染TGFβ1-ASODN后，对细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。5．统计学处理：所有数据均经SPSS13.0软件进行统计分析。计数数据采用阳性率表示，阳性率之间的比较采用χ~2检验(Chi-square)，阳性率间相关性采用Kendall相关进行比较；计量数据采用(?)±S表示，两组均数的比较用t检验(t-test)，两组以上均数的比较用方差分析(ANVOA)。显著性水平α=0.05。结果1．TGF-β1蛋白在食管鳞癌中的表达(85.0％)明显高于其在癌旁“正常”粘膜中的表达(27.0％)(P＜0.01)，其在深层浸润组中的表达(90.6％)高于其在浅层浸润组中的表达(75.0％)(P＜0.05)。2．E-cadherin蛋白在食管鳞癌中的表达(43％)明显低于其在癌旁“正常”粘膜中的表达(85％)(P＜0.01)；Vimentin蛋白在食管鳞癌中的表达(23％)高于其在癌旁“正常”粘膜中的表达(0％)(P＜0.05)。3．在食管鳞癌组织中，TGF-β1的表达与E-cadherin的表达呈负相关关系(T_b=-0.257，P＜0.05)；TGF-β1的表达与Vimentin的表达呈正相关关系(T_b=0.163，P＜0.05)；Vimentin的表达与E-cadherin的表达呈负相关关系(T_b=-0.379，P＜0.01)。4．RT-PCR结果显示EC9706细胞系中可检测到TGF-β1mRNA(0.43±0.09)、E-cadherin mRNA(0.22±0.06)、Vimentin mRNA(0.89±0.09)的表达；免疫细胞化学结果显示在EC9706中存在TGF-β1蛋白(43.57％)、E-cadherin蛋白(12.53％)和Vimentin蛋白(17.97％)的表达；流式细胞术结果也显示在EC9706中存在TGF-β1蛋白(41.4％)、E-cadherin蛋白(12.2％)和Vimentin(17.8％)蛋白的表达。5．转染TGFβ1-ASODN后，RT-PCR结果表明，TGF-β1mRNA的表达水平(0.25±0.681)明显低于转染前(0.43±0.09)(P＜0.01)；免疫细胞化学结果表明，转染后TGF-β1蛋白的表达(35.07％)明显低于转染前(43.57％)(P＜0.01)，且细胞浆着色减弱；流式细胞术结果表明，转染后TGF-β1蛋白的表达(35.4％)明显低于转染前(41.38％)(P＜0.01)。6．RT-PCR结果表明，转染TGFβ1-ASODN后，E-cadherin mRNA的表达(0.38±0.09)明显高于转染前(0.22±0.06)(P＜0.01)；Vimentin mRNA的表达(0.73±0.07)低于转染前(0.89±0.09)(P＜0.05)。免疫细胞化学结果表明，转染后，E-cadherin蛋白的表达(17.13％)明显高于转染前(12.53％)(P＜0.01)；Vimentin蛋白的表达(14.15％)明显低于转染前(17.97％)(P＜0.01)。流式细胞术结果表明，转染后E-cadherin蛋白的表达率(17.8％)明显高于转染前(12.2％)(P＜0.01)；Vimentin蛋白的表达(14.9％)明显低于转染前(17.8％)(P＜0.01)。7．转染后细胞形态变圆，颗粒增多，呈立方形或椭圆形；而对照组细胞贴壁生长良好，细胞轮廓清楚，呈纺锤形或长梭形。8．划痕试验结果显示，转染TGFβ1-ASODN的EC9706细胞的迁移距离在24h(0.14±0.02)、48h(0.30±0.06)、72h(0.45±0.05)均较转染前24h(0.23±0.02)、48h(0.69±0.12)、72h(0.81±0.11)减少(P＜0.05)。9．流式细胞术结果表明，转染后细胞凋亡百分率(0.69％)低于转染前(0.96％)(P＜0.05)；转染后，G1期的细胞百分比(62.9％)明显低于转染前(66.5％)(P＜0.01)，S期细胞百分比(21.3％)明显低于转染前(23.7％)(P＜0.01)，G2期的细胞百分比(14.8％)明显高于转染前(9.8％)(P＜0.01)。MTT结果表明，转染TGFβ1-ASODN后72h，细胞存活率(109.4％)高于转染前(100％)(P＜0.05)。结论1．TGF-β1蛋白在食管鳞癌组织中及食管鳞癌细胞系EC9706中高表达，且在食管鳞癌中TGF-β1蛋白表达与E-cadherin蛋白表达的负相关关系，与Vimentin蛋白表达的正相关关系提示食管鳞癌发生发展过程中可能存在TGF-β1引发的EMT。2．转染TGFβ1-ASODN，可特异性地抑制食管鳞癌细胞EC9706中的TGF-β1表达。3．TGFβ1-ASODN转染EC9706细胞，可导致细胞上皮性标志物E-Cadherin表达上调、间质性标志物Vimentin表达下调、形态发生改变、移动能力减弱，提示阻断TGFβ1信号可抑制食管鳞癌细胞EC9706的EMT过程。4．TGFβ1-ASODN阻断TGFβ1表达后，可能解除了TGFβ1对食管鳞癌细胞EC9706的生长抑制作用和凋亡促进作用。