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近年来随着静脉置管、导尿管等临床应用的发展,化疗、器官移植等免疫缺陷病例的增加,条件性真菌感染病例日益增多,临床广谱真菌抗生素耐受日趋严重。例如白色念珠菌因其顽固的抵抗常规抗真菌制剂,特别是5氟胞嘧啶(5FC),已成为一个医疗难题。由于新抗真菌化合物的毒副作用显著,使联合用药成为解决真菌耐药性的重要措施。本文以模式真菌酿酒酵母的突变体库筛选到5FC敏感基因GCN5,推测组蛋白乙酰化酶(GCN5编码)抑制剂与5FC有联合抑菌效应,并进一步研究其中的机制和机制在真菌中的保守性。
首先,通过酿酒酵母缺失突变体库筛选到12株5FC敏感突变菌,耐药性分析、基因测序确定5FC响应超敏感基因GCN5,GCN5编码组蛋白乙酰转移酶,同工基因ADA2突变同样表现5FC超敏感性状;推测组蛋白乙酰化酶抑制剂姜黄素(CUR)与5FC有联合抑菌效应,通过抑菌活性检测,FICI测定证实两者FIC指数低于0.5,有很好的协同抑菌效果。接下来构建了GCN5和同工基因ADA2过表达质粒,过表达GCN5和ADA2能恢复或增强突变体和野生菌株5FC耐受性。通过半定量PCR分析5FC处理降低GCN5表达。进一步分析白色念珠菌CaGCN5与酿酒酵母GCN5有高度同源性,两者的相似性达到75%;过表达GCN5与CaGCN5均可以缓解5FC或CUR诱导的染色体凝集和细胞周期的阻滞,表明5FC与CUR通过GCN5联合抑菌作用具有高度的保守性,对临床上治疗5FC耐药性真菌感染有重要参考价值。
其次,遗传分析细胞壁合成缺陷(chs1Δ,chs3Δ)和DNA损伤修复缺陷(rad1Δ)对5FC和CUR药物的耐受性不同,表明5FC和CUR抗真菌机理不完全相同。进一步探究5FC与CUR的协同抗菌机制,我们用PI染色检测细胞质膜的完整性,RH123模拟CUR细胞吸收实验,SEM检测化合物对细胞形态影响,结果表明5FC处理抑制细胞壁的合成使细胞膜的通透性提高,促进CUR进入细胞,这与细胞壁合成缺陷菌株chs1Δ有相似性状。
最后,我们探究了5FC抑菌活性与GCN5之间的关系,发现GCN5过表达可以促进真菌侵入性生长,增强细胞毒力作用;疏水性检测和菌膜含量检测显示,过表达菌株中疏水性增强菌膜含量升高;真菌固体培养基板洗实验显示,GCN5过表达菌株有假菌丝形成和侵入性生长现象,但5FC处理下的侵入性生长现象消失,SEM成像显示5FC会破坏菌膜形成细胞出现穿孔现象。在白色念珠菌中也观察到相似的性状,无论在固体还是液体(FBS诱导)培养基,5FC处理下的白色念珠菌,菌丝消失,细胞呈现正常的不致病的酵母形态。表明5FC通过下调GCN5抑制菌膜形成而干预真菌感染性。
总之,以上研究结果表明,GCN5是5FC抑制真菌生长的重要靶向调控基因,5FC与CUR具有联合抑制GCN5的功能阻滞细胞增殖作用;同时,5FC通过抑制细胞细胞壁的合成改变膜的通透性促进细胞对CUR的吸收利用。此外,5FC通过下调GCN5抑制菌膜的合成、干预真菌侵入性生长,达到抑菌作用。
首先,通过酿酒酵母缺失突变体库筛选到12株5FC敏感突变菌,耐药性分析、基因测序确定5FC响应超敏感基因GCN5,GCN5编码组蛋白乙酰转移酶,同工基因ADA2突变同样表现5FC超敏感性状;推测组蛋白乙酰化酶抑制剂姜黄素(CUR)与5FC有联合抑菌效应,通过抑菌活性检测,FICI测定证实两者FIC指数低于0.5,有很好的协同抑菌效果。接下来构建了GCN5和同工基因ADA2过表达质粒,过表达GCN5和ADA2能恢复或增强突变体和野生菌株5FC耐受性。通过半定量PCR分析5FC处理降低GCN5表达。进一步分析白色念珠菌CaGCN5与酿酒酵母GCN5有高度同源性,两者的相似性达到75%;过表达GCN5与CaGCN5均可以缓解5FC或CUR诱导的染色体凝集和细胞周期的阻滞,表明5FC与CUR通过GCN5联合抑菌作用具有高度的保守性,对临床上治疗5FC耐药性真菌感染有重要参考价值。
其次,遗传分析细胞壁合成缺陷(chs1Δ,chs3Δ)和DNA损伤修复缺陷(rad1Δ)对5FC和CUR药物的耐受性不同,表明5FC和CUR抗真菌机理不完全相同。进一步探究5FC与CUR的协同抗菌机制,我们用PI染色检测细胞质膜的完整性,RH123模拟CUR细胞吸收实验,SEM检测化合物对细胞形态影响,结果表明5FC处理抑制细胞壁的合成使细胞膜的通透性提高,促进CUR进入细胞,这与细胞壁合成缺陷菌株chs1Δ有相似性状。
最后,我们探究了5FC抑菌活性与GCN5之间的关系,发现GCN5过表达可以促进真菌侵入性生长,增强细胞毒力作用;疏水性检测和菌膜含量检测显示,过表达菌株中疏水性增强菌膜含量升高;真菌固体培养基板洗实验显示,GCN5过表达菌株有假菌丝形成和侵入性生长现象,但5FC处理下的侵入性生长现象消失,SEM成像显示5FC会破坏菌膜形成细胞出现穿孔现象。在白色念珠菌中也观察到相似的性状,无论在固体还是液体(FBS诱导)培养基,5FC处理下的白色念珠菌,菌丝消失,细胞呈现正常的不致病的酵母形态。表明5FC通过下调GCN5抑制菌膜形成而干预真菌感染性。
总之,以上研究结果表明,GCN5是5FC抑制真菌生长的重要靶向调控基因,5FC与CUR具有联合抑制GCN5的功能阻滞细胞增殖作用;同时,5FC通过抑制细胞细胞壁的合成改变膜的通透性促进细胞对CUR的吸收利用。此外,5FC通过下调GCN5抑制菌膜的合成、干预真菌侵入性生长,达到抑菌作用。