研究目的:肥胖(Obesity)是由于机体能量摄入超过消耗,导致脂肪细胞体积增大、数目增多,体脂百分比增高,并在腹腔、肝脏、心脏、骨骼肌等局部出现脂肪沉积为特点的一种疾病。传统观点认为,遗传因素、饮食因素、精神因素以及久坐、缺乏运动等生活方式的改变是肥胖发生的主要原因。然而,当今全球肥胖、尤其是儿童肥胖人口迅速增加这一现象用传统的肥胖发生学说已难以完全解释。动物实验和人群研究均表明,在特定的饮食环境下(如高脂、高热量饮食),部分实验对象易发肥胖,而另一部分受试者则可维持正常体重,提示除饮食因素外其他因素也可能参与影响个体的代谢表型。既往大量研究集中在对肥胖发生的遗传学机制以及环境因素诱发肥胖的病理基础的探讨,最新研究发现亲代(F0)表观遗传修饰改变可能通过跨代继承(Transgenerational inheritance)引起后代(F1)对肥胖和2型糖尿病(Type 2 Diabetes,T2DM)易感,而运动作为一个良性刺激可对机体组织细胞表观遗传修饰产生影响。已有研究证实孕母在孕期进行规律的运动可以改善孕期营养异常导致的后代对肥胖和代谢性疾病易感的趋势。但是,关于饮食与运动因素干预父系是否会对其子代代谢表型产生影响的研究尚未见报道。对雄性大鼠进行高脂饮食干预可引起F1代雌性大鼠β细胞功能紊乱,对肥胖和胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)易感性增加。这一发现提示父代的饮食习惯可对子代的代谢表型和疾病的易感性产生影响。因此,本研究以有氧运动/高脂饮食干预父代小鼠可能对其子代的代谢表型产生影响为假设,通过6周有氧运动/高脂饮食干预雄性C57BL/6小鼠以建立动物模型,验证模型小鼠与同窝正常饮食安静喂养雌鼠交配产生的子代小鼠生长发育、能量代谢表型等指标,采用组织学染色技术和分子生物学技术研究影响F1小鼠代谢表型的分子机理。本研究试图揭示有氧运动作为一种健康的生活方式不仅对运动者本身健康有益,还可能通过跨带继承的方式对其后代的代谢表型产生影响;而父系长期高脂饮食除造成自身的肥胖及代谢紊乱外,还可能通过表观遗传修饰的改变对子代的代谢表型产生不良影响。研究方法:(1)实验用C57BL/6小鼠的繁殖和选择:同窝C57BL/6雄性小鼠(F0)自出生21天断乳后随机分为正常饮食安静组(C)、高脂饮食组(H)和正常饮食有氧运动组(E),同窝雌性小鼠以正常小鼠饲料安静喂养以备交配使用。6周后将各组雄性小鼠与同窝雌鼠1:1交配产下F1代小鼠;(2)运动干预方案:运动组进行为期6周、75%VO2max强度的跑台运动,1次/天、60min/次、5次/周;(3)高脂饮食干预方案:高脂饮食组采用Research Diet Inc的高脂饮食饲料(热量比为:蛋白质20%,碳水化合物20%,脂肪60%)喂养6周;(4)F1代小鼠生长指标的检测:测量F1代小鼠体重、身长、肾周与附睾周脂肪组织重量、计算脂肪组织重量占体重的百分比;(5)F1代小鼠口服葡萄糖耐量实验(OGTT):F1代小鼠分别在出生后4周及8周检测OGTT。实验小鼠需禁食16小时,实验前称量小鼠体重并记录,经鼠尾静脉取微量血以检测空腹血糖值,并将此时间点血糖值设定为T0。按每公斤体重10μl/g经口腔灌注20%葡萄糖溶液,分别检测T15,T30,T60和T120各时间点血糖值;(6)采用ELISA检测F1代小鼠空腹血脂、胰岛素:F1小鼠禁食14-16小时后,处死动物取血清,行血脂、胰岛素分析;(7)采用H&E染色观察F1代小鼠胰腺组织形态学指征:F1代小鼠禁食16小时后,经腹膜下注射水合氯醛溶液麻醉后,立即分离小鼠的胰腺组织,经10%中性福尔马林固定,依次经不同浓度梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋,制成石蜡切片。H&E染色石蜡切片,镜下观察胰腺形态;(8)采用Real-Time PCR法检测F1代小鼠附睾周脂肪PPAR-γ,TNF-α及Adiponectin基因表达;(9)采用亚硫酸氢盐转化焦磷酸测序方法检测F1代小鼠附睾周脂肪PPARγ-437位点甲基化水平。研究结果:(1)性别差异:CO,HFO,EO三组小鼠在正常饮食条件下,生长发育曲线和OGTT曲线无统计学差异。但是,在给予三组小鼠4周高脂饮食干预后发现,与CO组小鼠相比,HFO及EO组雄性子代小鼠生长发育曲线和OGTT曲线出现显著性差异,而雌性子代小鼠及全部的子代小鼠生长发育曲线和OGTT曲线均无统计学差异,故本研究仅选取雄性子代小鼠作为研究的对象;(2)F1代小鼠生长发育指标:在正常饮食条件下F1代小鼠体重、身长增长无统计学差异。但是,在给予小鼠4周高脂饮食喂养后发现,与CO组小鼠相比,HFO组小鼠体重在高脂饮食喂养期间显著增加且体重增长速度显著高于CO组小鼠(P<0.05);而EO组小鼠的体重在高脂喂养期间显著降低且体重下降速度显著低于CO组小鼠(P<0.05);(3)肾周及附睾周脂肪组织重量:腹腔脂肪组织包括附睾周脂肪组织(Epididymis Fat,EF)和肾周脂肪组织(Perirenal Fat,PF),分别对其进行称重后,数据经统计学软件分析发现,与CO组小鼠相比,HFO组小鼠EF,PF,及腹腔脂肪组织总量(Total Fat,TF)重量分别高42.47%,50.28%,44.31%,均有统计学意义(P<0.05),而EO组小鼠EF,PF,TF重量分别低39.86%,55.97%,43.25%,均有统计学意义(P<0.05);(4)脂肪量与体重比:为避免因小鼠体重差异造成的腹腔脂肪重量的误差,本实验将分别以每只小鼠腹腔脂肪重量除以自身体重,以脂肪重量与体重比值(F/W%)作为小鼠绝对腹腔脂肪量。结果经统计学软件分析发现,与CO组小鼠相比,HFO组小鼠附睾周脂肪组织重量与体重比(EF/W)、肾周脂肪组织重量与体重比(PF/W)、及腹腔脂肪组织总量与体重比(TF/W)数值分别高36.26%,44.94%,38.31%,均有统计学意义(P<0.05);而EO组小鼠EF/W,PF/W及TF/W数值分别低34.64%,52.32%,38.37%,均有统计学意义(P<0.05);(5)OGTT:与CO组小鼠相比,正常饮食喂养下的F1代小鼠无论HFO组还是EO组OGTT曲线及曲线下面积均无显著性改变。但是在给予小鼠4周高脂饮食喂养后发现,与CO组小鼠相比,HFO组小鼠表现出对高脂饮食引发的代谢异常敏感;而EO组小鼠表现出对高脂饮食引发的代谢异常具有抵抗作用;(6)血脂全项:与CO组小鼠相比,HFO组小鼠血清TG,T-CHD,LDL-C,FFA分别高32.12%,15.03%,20.85%,13.43%,而HDL-C低17.61%,均有统计学意义(P<0.05);EO组小鼠血清TG,T-CHD,LDL-C,FFA分别低67.49%,17.76%,64.50%,10.16%,均有统计学意义(P<0.05);而HDL-C高19.69%,无统计学意义(P>0.05);(7)空腹血糖与胰岛素:与CO组小鼠相比,HFO组小鼠空腹血糖高3.15%,无显著性差异(P>0.05),而EO组小鼠空腹血糖低26.49%,有显著性差异(P<0.05);与CO组小鼠相比,HFO组小鼠和EO组小鼠空腹血胰岛素分别高8.60%和28.62%,均无显著性差异(P>0.05);(8)胰腺组织形态学指征:H&E染色观察F1代雄性小鼠胰腺组织形态学指征发现,CO,HFO,EO三组小鼠胰岛β细胞团面积无显著差异,细胞团边缘清晰,无明显炎性浸润发生;(9)附睾周脂肪组织PPARγ,TNFα及Adiponectin基因表达:EO组小鼠附睾周脂肪组织PPARγ及Adiponectin基因表达较CO组分别高23.23%和45.88%,有统计学意义(P<0.05),而TNFα基因表达较CO组低19.16%,无统计学差异(P>0.05);HFO组小鼠附睾周脂肪组织PPARγ及Adiponectin基因表达较CO组低29.37%和9.14%,无统计学差异(P>0.05),而TNFα基因表达较CO组高57.42%,有统计学意义(P<0.05);(10)附睾周脂肪组织PPARγ-437位点甲基化水平:EO组小鼠附睾周脂肪组织PPARγ启动子1区-437位点甲基化程度较CO组高5.41%,无统计学差异(P>0.05);而HFO组小鼠附睾周脂肪组织PPARγ启动子1区-437位点甲基化程度较CO组高11.54%,有显著性差异(P<0.01)。研究结论:(1)有氧运动/高脂饮食干预父代C57BL/6小鼠能够对其子代代谢表型产生影响,但仅限于雄性子代;(2)与CO组小鼠相比,EO组雄性小鼠在正常饮食环境下代谢表型无显著性差异,但是,在给予4周高脂饮食喂养后,EO组小鼠代谢表型出现显著差异,OGTT结果也提示EO组小鼠对高脂饮食引发的糖耐量异常具有抵抗作用;(3)与CO组小鼠相比,HFO组雄性小鼠在正常饮食环境下代谢表型无显著性差异。但是,在给予4周高脂饮食喂养后,HFO组小鼠代谢表型有显著差异,OGTT结果也提示HFO组小鼠对高脂饮食引发的糖耐量异常敏感;(4)附睾周脂肪组织PPARγ检测显示EO组小鼠腹腔脂肪量的减少可能与其附睾周脂肪组织PPARγ和Adiponectin基因表达呈负相关,与TNFα基因表达呈正相关;(5)附睾周脂肪组织PPARγ检测发现HFO组小鼠腹腔脂肪量的增多可能与其附睾周脂肪组织PPARγ和Adiponectin基因表达呈负相关,与TNFα基因表达呈正相关;(6)甲基化检测发现PPARγ基因表达的变化可能与PPARγ基因启动子1区-437位点甲基化水平呈负相关,提示父系的生活方式可能通过子代小鼠附睾周脂肪组织PPARγ基因甲基化水平的改变来影响PPARγ基因的表达,进而对其子代小鼠腹腔内脂肪组织量等代谢表型产生影响。