【摘 要】
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乳腺癌作为女性常见的恶性肿瘤,已位居我国女性恶性肿瘤之首。其治疗方案主要取决于肿瘤的分型和疾病的分期,而患者腋窝淋巴结的转移情况直接影响疾病的分期,也是确定治疗方案的重要依据。本课题围绕乳腺癌患者腋窝淋巴结细针穿刺洗脱液标本开展研究,旨在发现新的检测方法以提高乳腺癌患者术前可疑淋巴结诊断的检测敏感性;分析标本中CD8+T细胞表面PD-1及胞内因子表达,为评估机体免疫应答状态提供依据,并探索评估乳腺
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乳腺癌作为女性常见的恶性肿瘤,已位居我国女性恶性肿瘤之首。其治疗方案主要取决于肿瘤的分型和疾病的分期,而患者腋窝淋巴结的转移情况直接影响疾病的分期,也是确定治疗方案的重要依据。本课题围绕乳腺癌患者腋窝淋巴结细针穿刺洗脱液标本开展研究,旨在发现新的检测方法以提高乳腺癌患者术前可疑淋巴结诊断的检测敏感性;分析标本中CD8+T细胞表面PD-1及胞内因子表达,为评估机体免疫应答状态提供依据,并探索评估乳腺癌患者疾病严重程度的新指标。乳腺癌初发患者腋窝淋巴结细针穿刺洗脱液及血液标本来自上海交通大学医学院附属瑞金医院。首先,我们建立了“比值法”（穿刺洗脱液肿瘤标志物检测值/血清肿瘤标志物检测值）新型分析方法。分别检测血清和穿刺洗脱液中癌胚抗原（CEA）、糖类抗原15-3（CA15-3）和细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）的含量,评估肿瘤标志物对乳腺癌转移淋巴结的诊断价值;并结合超声引导下的细针穿刺的细胞学检测（US-FNAC）探究最佳联合诊断方法。其次,我们采用流式细胞术分析患者转移淋巴结组和阴性淋巴结组穿刺液洗脱液中CD8+T细胞的比例、亚群分布、细胞表面PD-1及胞内IFN-γ、TNF-α和Granzyme B的表达,以反映不同类型淋巴结中CD8+T细胞的亚群格局和功能;通过分析转移淋巴结中CD8+T细胞表面PD-1表达与乳腺癌患者病理参数之间的关系,探讨在转移淋巴结穿刺洗脱液中PD-1作为参考指标评估乳腺癌严重程度的可能性。第一部分实验结果显示:（1）US-FNAC对乳腺癌腋窝转移淋巴结诊断的敏感性为83.7%,特异性为100%、准确性为88.4%。（2）血清CEA、CA15-3和CYFRA21-1对乳腺癌转移淋巴结的阳性检出率分别为17.4%、21.1%和47.7%。（3）穿刺洗脱液CEA、CA15-3和CYFRA21-1对乳腺癌转移淋巴结诊断的敏感性分别为50.1%、44.8%和95.3%,特异性分别为92.9%、91.4%和92.9%,准确性分别为62.8%、58.3%和94.6%。（4）CEA、CA15-3和CYFRA21-1的比值法分析对乳腺癌转移淋巴结诊断的敏感性分别为47.7%、40.1%和94.2%,特异性均为100%,准确性分别为62.8%、57.4%和95.9%。（5）US-FNAC与上述各种方法联合诊断结果显示,US-FNAC联合CYFRA21-1的比值法分析对乳腺癌转移淋巴结诊断的检测性能达到最优,能将检测的敏感性提高到97.1%,特异性保持100%、准确性提高到97.9%。第二部分实验结果显示:（1）与阴性淋巴结组相比,乳腺癌患者腋窝转移淋巴结组CD8+T细胞中初始T细胞(TNaive)比例降低,效应记忆T细胞(TEM)比例升高,中央记忆T细胞(TCM)和CD45RA+效应记忆T细胞(TEMRA)比例无明显变化。（2）与阴性淋巴结组相比,转移淋巴结组CD8+T细胞表面PD-1表达增高,胞内IFN-γ和TNF-α表达增强;但PD-1+CD8+T细胞内IFN-γ、TNF-α、Granzyme B的表达降低,而PD-1-CD8+T细胞内上述因子表达增高。（3）转移淋巴结中CD8+T细胞表面PD-1表达与乳腺癌TNM分期及淋巴结转移数量呈正相关。我们发现US-FNAC洗脱液是一种新颖的标本来源,洗脱液肿瘤标志物CYFRA21-1检测在诊断方法学中的表现优于CEA和CA15-3,新型创建的CYFRA21-1比值法分析联合US-FNAC检测能在不降低方法学特异性的同时显著提高对腋窝淋巴结的诊断敏感性,可以减少乳腺癌患者的前哨淋巴结活检率。利用流式细胞仪对洗脱液中淋巴细胞进行分析,发现转移淋巴结组中CD8+T细胞亚群由TNaive向TEM细胞分化且功能增强,揭示转移淋巴结中CD8+T细胞抗肿瘤能力的变化。转移淋巴结组中PD-1+CD8+T细胞比例增多、功能下降;CD8+T细胞表面PD-1的高表达与乳腺癌TNM分期级别增高及淋巴结转移数量增多相关,提示转移淋巴结洗脱液中CD8+T细胞表面PD-1表达的比例可以作为参考指标评估乳腺癌患者疾病严重程度。综上所述,本课题的研究可为乳腺癌转移淋巴结的诊断和乳腺癌的靶向治疗提供新思路。
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