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卡介菌多糖核酸(Bacillus Calmette Guerin polysaccharide nucleic acid, BCG-PSN)是一种新型免疫调节剂,具有以下几方面作用：提高T淋巴细胞免疫功能；激活T淋巴细胞促进白细胞介素等分泌从而产生多种免疫调节的淋巴因子；增强巨噬细胞功能,提高机体杀伤细菌、病毒能力；提高溶菌酶活力。经临床试验证实,BCG-PSN目前已成为防治哮喘、慢性支气管炎、风湿性关节炎、神经性皮炎等较为理想的药物。为进一步提高BCG-PSN的疗效并减少其不良反应,我们在本试验中采用独特的低温细菌细胞破壁、热酚法提取法分离和提纯BCG-PSN,并设计了适合本药物的的薄膜蒸发法制备BCG-PSN脂质体。同时为了提高稳定性,我们制备了BCG-PSN冻千脂质体。在此基础上,我们对BCG-PSN免疫增强作用及其安全性进行评价,为BCG-PSN在畜牧养殖业中的应用提供试验和理论依据。1. BCG-PSN制备条件的优化及其质量控制 为了优化BCG-PSN制备工艺,试验采用超声破碎BCG-PSN的细胞壁,利用热酚法除去菌体蛋白,以多糖核酸的含量为考察指标,选取苯酚浓度、热酚次数以及乙醇用量三个因素,每个因素三个水平,通过正交试验L9(33)确定BCG-PSN的最佳提取工艺条件。结果表明：对BCG-PSN提取量影响因素的大小依次是热酚次数、苯酚浓度、乙醇用量,并且90%苯酚、热酚处理次数为4次、浓缩液：乙醇为1：5时,所获得的BCG-PSN含量最大(96.488%),而且对上述最佳工艺进行了重复性验证,证实其具有良好的重现性。2. BCG-PSN脂质体的制备 根据水溶解性药物的特点,本论文选用经典的薄膜蒸发法制备BCG-PSN脂质体(下图是磷脂双分子层示意图,其中BCG-PSN所在位置在双分子层最中间部分),并采用星点设计-归一化法优化普通BCG-PSN脂质体(FBL)的处方。并在单因素考察的基础上,确定三个自变量为BCG-PSN/卵磷脂(%,w/w)、胆固醇／卵磷脂(%,w/w)以及BCG-PSN加入量(mg)；因变量为包封率(%)、收率(%)、粒径与5000nnm的差以及径距。结果表明,以优化处方制备样品,各指标实测值与预测值偏差较小。3. BCG-PSN冻干脂质体的制备及其稳定性 本论文通过正交试验得到最佳处方,确定BCG-PSN冻干脂质体(PBL)的最佳参数。在此基础上,对修饰前后BCG-PSN脂质体的性质及其在光照、分散介质、模拟生物环境中以及长期放置稳定性进行了研究,并同时以BCG-PSN注射液为对照。结果显示BCG-PSN冻干脂质体体外稳定性较普通BCG-PSN脂质体更强。4. BCG-PSN与IBO疫苗联合应用对鸡的免疫增强作用0.6 mg·kg-1,0.3 mg·kg-1,0.15 mg·kg-1,0.075 mg-kg-1和0.0375 mg·kg-1的BCG-PSN与IBD疫苗联合应用于人工感染IBD的受试雏鸡,通过测定免疫器官指数、IBD抗体滴度、外周血T淋巴细胞亚群、巨噬细胞吞噬活性、血清IFN-y及IL-2浓度等免疫学指标,研究BCG-PSN和IBD疫苗的免疫协同作用效果。结果表明,与单用IBD疫苗比较,极高剂量(0.6 mg·kg-1) BCG-PSN能够极显著地升高脾脏和胸腺系数,中(0.15 mg·kg-1).低(0.075 mg·kg-1)剂量BCG-PSN能极显著延缓法式囊退化；中剂量(0.15 mg·kg-1)的BCG-PSN能够明显诱导IBD抗体的产生和提高CD4+/CD8+T淋巴细胞比值,维持CD4+和CD8+T淋巴细胞的平衡；BCG-PSN显著升高鸡血清IFN-y和IL-2含量,而且作用持续时间相对较长,尤其对IL-2的持续诱导效果更为明显。因此,与IBD疫苗联合应用,BCG-PSN能够剂量相关性的促进鸡机体产生相应抗体,同时增强机体体液免疫和细胞免疫作用；BCG-PSN对非特异性免疫没有明显影响。5. BCG-PSN安全性 以药物最大溶解度为最高剂量,剂间比1：0.83,小鼠腹腔注射不同剂量的BCG-PSN,测定其急性毒性；小鼠腹腔注射不同剂量的BCG-PSN,连续给药14d,观察其亚慢性毒性；小鼠腹腔注射不同剂量的BCG-PSN,以小鼠骨髓微核和精子畸形为指标,评价其其致突变作用。结果表明,腹腔注射不同剂量的BCG-PSN,最高剂量2000 mg·kg-1·bw-1,连续观察14d,小鼠仅出现轻微的中毒症状,未出现死亡,故小鼠腹腔注射BCG-PSN的最大给药量为2000 mg·kg-1·bw-1;与正常对照组比较,亚慢性毒性试验小鼠在整个试验周期内反应灵敏、活动正常且未出现死亡；BCG-PSN高、中剂量组小鼠进食量在前期显著降低,高剂量组小鼠体重在试验前期显著下降；高剂量组脾脏指数显著升高,高、中剂量组白细胞总数、红细胞总数、血红蛋白、红细胞压积和平均红细胞容积显著降低,尿素氮显著升高,高剂量组白蛋白显著降低。其他各项指标及病理组织学检查结果与正常对照组没有显著性差异。小鼠致畸初步试验结果表明,BCG-PSN对骨髓微核和精子畸形试验结果均为阴性。实验结论,小鼠腹腔注射BCG-PSN的最大给药量为2000 mg·kg-1·bw-1,长期大剂量应用BCG-PSN可能引起贫血,无致突变作用。