研究背景支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性气道炎症性疾病,但免疫机制尚不能完全解释哮喘全貌,前期研究发现下丘脑-垂体-肾上腺皮质(Hypothalamus-Pituitar y-Adrenal, HPA)轴功能与哮喘关系密切,因此,我们对比了不同中医辨证分型哮喘患者的炎症及HPA轴功能指标,并进行炎症指标与HPA指标的相关性分析,旨在明确肺肾气(阳)虚型哮喘患者炎症及HPA轴功能状态。糖皮质激素是目前最为有效的抗炎治疗药物,但是部分患者仍控制不佳,并且长期使用糖皮质激素有副作用。中医药在防治哮喘方面积累了很多经验,我们结合中医治喘理论和本科室半个多世纪的研究成果,提炼出补肾及补肾益气法可从整体上改善哮喘患者体质,控制哮喘,并与现代医药相结合增强疗效,减少现代医药副作用。但由于历史的局限性,目前尚缺乏符合循证医学证据的临床试验验证其疗效,并且其内在机理尚不十分清楚。因此,有必要设计严格规范的临床方案验证并比较具有补肾及补肾益气功效的补肾防喘片与补肾益气方治疗肺肾气(阳)虚型哮喘的疗效,并从炎症、HPA轴功能角度出发探讨其内在机理,为临床应用提供循证医学证据。动物实验研究可以弥补临床研究的不足,为了明确补肾益气方药治疗肺肾气(阳)虚哮喘的药效物质基础,我们首先进行了肺肾气(阳)虚哮喘动物模型的探索。同时利用高效液相-电喷雾/四极杆-飞行时间串联质谱(High Performance Liquid Chromatography Electrospray/Quadrupole Time-of-Fight tandem Mass Sp ectrometry, HPLC-ESI/Q-TOF-MS/MS)技术快速鉴定了补肾防喘片中的化学成分。结合前期研究基础,我们推测淫羊藿苷可能是补肾益气方药治疗哮喘的主要活性成分,为了验证这一假设,我们观察了淫羊藿苷对肺肾气虚哮喘动物模型的干预作用并对其内在机理进行了探讨。第一章肺肾气(阳)虚型哮喘患者炎症与HPA轴功能状态及相关性研究目的：通过对比不同中医辨证分型的哮喘患者及正常健康人的血清、诱导痰、唾液、尿液中有关气道炎症、HPA轴功能的指标,拟明确肺肾气(阳)虚型哮喘患者炎症及HPA轴功能状态,为补肾益气方药干预哮喘的内在机理研究提供依据。方法：选取年龄18-65岁,性别不限,现代医学诊断为哮喘,中医辨证为肺肾气(阳)虚、肺气虚、阴虚火旺证；另选取年龄、性别匹配的健康人群作为对照组。同时排除合并肺部其他疾病的患者；一个月内使用糖皮质激素治疗的患者。在固定时间点采集所有研究对象外周血、诱导痰、唾液、24h尿液,用Bio-Plex悬液芯片检测痰上清液和血清中白细胞介素(Interleukin, IL)-6、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor, TNF-α)、转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-p, TGF-p)、干扰素-γ(Interferon-y, IFN-y)水平等以观察炎症情况；同时用放射免疫法检测血浆及唾液皮质醇,24h尿游离皮质醇(Urinary Free Cortisol, UFC)、17-羟皮质类固醇(尿17-羟)、17-酮类固醇(尿17-酮)等指标以评估HPA轴功能。结果：本研究共收集71例哮喘患者,其中肺肾气(阳)虚组28例,肺气虚组23例,阴虚火旺组20例,另选取41名健康体检者作为正常组。各组患者性别、年龄、体重指数、吸烟、病程、疾病严重程度均无统计学差异(P>0.05)。与正常组、肺气虚组比较,肺肾气(阳)虚组、阴虚火旺组血清TNF-a水平明显升高,而IFN-y明显降低(P<0.05),肺肾气(阳)虚组IL-6水平明显高于其他三组(P<0.05)。与正常组、肺气虚组比较,肺肾气(阳)虚组诱导痰中TNF-α、 TGF-β水平明显升高(P<0.05),阴虚火旺组诱导痰IFN-y明显降低(P<0.05)。肺肾气(阳)虚组尿游离皮质醇、17-羟水平明显低于其他三组,尿17-酮明显低于正常组及阴虚火旺组。与正常组、阴虚火旺组相比,肺肾气(阳)虚组晨8点及次日8点血皮质醇明显降低(P<0.05)；与正常组比较,肺肾气(阳)虚组晨8点及次日8点唾液皮质醇明显降低(P<0.05),与阴虚火旺组比较,肺肾气(阳)虚组次日晨8点唾液皮质醇明显降低(P<0.05)；肺气虚组亦出现血浆及唾液中晨8点及次日8点皮质醇水平降低,但与正常组比较无统计学差异。血清TNF-a.IL-6与血浆皮质醇呈明显的负相关(r=-0.26, P=0.03)、(r=-0.25, P=0.03),诱导痰IL-6与唾液皮质醇呈明显的负相关(r=-0.26,P=0.02)。血清IFN-y与尿17-羟呈明显的正相关(r=0.21,P=0.03)。结论：哮喘患者致炎因子增多,抑炎因子缺乏,处于致炎／抑炎平衡调控机制失衡状态,其中以肺肾气(阳)虚型哮喘患者改变尤为明显,可能与其HPA轴功能低下或紊乱有关。第二章补肾益气方药治疗肺肾气(阳)虚型哮喘的临床疗效观察及内在机理探讨目的：通过多中心、随机、双盲的临床试验,验证并对比补肾防喘片与补肾益气方治疗肺肾气(阳)虚型哮喘的疗效,并从炎症、HPA轴功能角度出发探讨其内在机理,为临床应用提供循证医学证据。方法：采用前瞻性、多中心、双盲的随机对照试验方法。受试对象来源于5家三级甲等医院门诊与病房,采用相同的入选和排除标准,将符合标准的哮喘患者随机分为补肾防喘片组、补肾益气方组、安慰剂组,三组在现代医学基础治疗上,分别加用补肾防喘片与补肾益气方模拟剂、补肾益气方与补肾防喘片模拟剂、补肾益气方模拟剂与补肾防喘片模拟剂,观察周期为3个月。(1)主要疗效指标：对比治疗期间急性加重情况,治疗前后肺功能改善情况；次要疗效指标：对比三组患者治疗后哮喘控制水平(Asthma Control Test, ACT)、哮喘症状量化评分、哮喘生活质量及中医证候量化评分的改善情况；(2)安全性指标：检测治疗前后血常规、尿常规、肝肾功能、血糖、心电图等相关安全性指标并详细记录不良事件与不良反应；(3)机理探讨：对比服药前后血清嗜酸性粒细胞(Eosinophil Granulocyte, EOS)计数、血总免疫球蛋白E (Total Immunoglobulin E, tIgE)水平；对比治疗前后血清中基质金属蛋白酶-9 (Matrix Metalloproteinase 9, MMP-9)、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-13、IL-17、IFN-γ、IL-2、IL-10水平；比较治疗前后血浆中促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin Releasing Hormone, CRH)、促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic Hormone, ACTH)、皮质醇水平。结果：(1)最终共纳入符合标准的患者295例。三组病例治疗前资料具有可比性(P>0.05)。治疗期间三组患者的哮喘急性加重率,经检验,无统计学差异(P=0.84)。补肾防喘片可显著改善一秒用力呼吸容积(Forced Expiratory Volume in One Second, FEV1)占预计值%,与安慰剂比较,P<0.05,补肾益气方有改善FEV1占预计值%的趋势；与安慰剂组比较,补肾防喘片、补肾益气方有改善FEVl/用力肺活量(Forced Vital Capacity, FVC)%的趋势；补肾防喘片治疗后ACT平均增加5.4分,补肾益气方治疗后ACT平均增加4.99分,安慰剂组增加4.9分,两两比较无统计学差异(P=0.74)；补肾防喘片治疗后哮喘日间无症状天数平均增加6.42天,补肾益气方组为5.9天,而安慰剂组为5.35天,但三组比较无统计学差异(P=0.33)；三组哮喘生活质量评分比较,无统计学差异(P=0.25),但中药组治疗后改善的幅度比安慰剂组明显；补肾防喘片、补肾益气方对中医证候有改善作用,尤其是自汗、腰膝酸软、畏寒肢冷等肺气虚、肾阳气虚中医证候的改善程度比安慰剂明显；(2)三组服药前后安全性指标组间比较,P>0.05,不良事件／不良反应发生率组间比较,P>0.05,无严重不良事件报告。(3)补肾防喘片、补肾益气方治疗后血EOS明显下降,但与安慰剂组比较,无统计学差异(P>0.05)；补肾益气方治疗后血清t IgE有明显下降趋势,而补肾防喘片组、安慰剂组治疗后升高,组间比较无统计学差异(P>0.05)；补肾益气方治疗后IL-2、IL-10水平升高,与补肾防喘片组、安慰剂组比较,有显著统计学差异(P=0.006,P=0.04)；补肾益气方、补肾防喘片服药后血清中IFN-y水平降低,与安慰剂组比较,有统计学差异(P=0.01)；补肾益气方、补肾防喘片治疗后血清MMP-9、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平较服药前均有明显下降,且下降幅度比安慰剂组明显,但组间比较无统计学差异(P>0.05)；补肾益气方治疗后血浆CRH、ACTH、皮质醇水平均有明显升高,补肾防喘片治疗后血浆ACTH水平亦有升高的趋势,而安慰剂组治疗后均下降。结论：补肾防喘片可显著升高FEV1占预计值%,补肾益气方亦有改善FEV1占预计值%的趋势；观察期间由于各组均在吸入糖皮质激素治疗的基础上,补肾防喘片和补肾益气方减少哮喘急性发作的作用不明显,但补肾益气方与补肾防喘片治疗后均有改善肺功能,提高哮喘控制水平,减轻日间哮喘症状,提高生活质量,改善肺肾气(阳)虚证候的作用；机理研究表明降低致炎因子水平,升高抑炎因子水平,纠正致炎／抑炎平衡调控机制失衡,改善HPA轴功能,提高内在抗炎能力可能是补肾防喘片、补肾益气方治疗肺肾气(阳)虚型哮喘的内在机理；补肾防喘片与补肾益气方是治疗哮喘安全可靠的中成药,值得在临床上推广应用。第三章肺肾气(阳)虚哮喘病证结合动物模型的探索性研究目的：探索肺肾气(阳)虚哮喘病证结合模型的建立方法,为药效物质基础研究奠定基础。方法：1.皮质酮诱导法与多因素应激法建立的肾阳虚大鼠模型及肺肾气(阳)虚哮喘模型的对比研究：将60只SD大鼠按随机数字法分为6组,每组10只,即正常组、皮质酮肾阳虚组、应激肾阳虚组、肺气虚哮喘组、皮质酮肺肾气(阳)虚哮喘组、应激肺肾气(阳)虚哮喘组。皮下注射皮质酮建立皮质酮肾阳虚模型；多因素复合应激即每日予以寒冷、强迫游泳、慢性间断性足底电刺激、束缚等应激因素模拟“恐伤肾”建立应激肾阳虚模型；卵蛋白(Ovalbumin, OVA)诱导建立肺气虚哮喘模型；在皮下注射皮质酮基础上,结合OVA诱导建立皮质酮肺肾气(阳)虚哮喘模型；在多因素复合应激基础上,结合OVA诱导建立应激肺肾气(阳)虚哮喘模型。观察各组大鼠一般状态、体重、饮食水量；采用旷场试验、糖水消耗试验检测行为学；计算胸腺、脾脏、甲状腺、肾上腺、睾丸脏器指数；酶联免疫吸附(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)法检测血浆ACTH、皮质酮、三碘甲状腺原氨酸(3,5,3’-triiodothyronine, T3)、甲状腺素(Thyroxine, T4)、促甲状腺素(Thyroid-Stimulating Hormone, TSH)、雌二醇(Estradiol, E2)、睾酮(Testosterone, T)、黄体生成素(Luteinizing Hormone, LH)、促卵泡素(Follicle Stimulating Hormone, FSH)以评估下丘脑-垂体-靶腺轴功能,检测血浆环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate, c AMP)及环磷酸鸟苷(Cyclic Guanosine Monophosphate, c GMP)含量以观察交感/副交感神经功能；Buxco动物有创肺功能检测系统测定气道高反应(Airway Hyperresponseiveness, AHR); Bio-Plex悬液芯片技术检测血清与肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF)中7种细胞因子水平；苏木精伊红(Hematoxylin and Eosin, HE)染色、过碘酸雪夫氏(Periodic Acid-Schiff, PAS)染色及马松三色(Masson’s Trichrome, M-T)染色分别观察肺组织炎症、粘液分泌、胶原沉积情况。2.社交应激性“恐伤肾”致肺肾气虚哮喘小鼠的建立及评价：将36只Balb/c小鼠按随机数字法分为4组,每组9只,即正常组、“恐伤肾”致肾气虚组、肺气虚哮喘组、“恐伤肾”致肺肾气虚哮喘组。利用啮齿类动物之间的领地占领攻击模拟“恐伤肾”建立肾气虚模型,OVA诱导建立肺气虚哮喘模型,观察一般状态,旷场试验检测行为学指标；Buxco动物有创肺功能检测系统测定AHR；ELISA检测BALF及血清中炎症因子和皮质酮的水平；HE染色观察肺组织炎症情况；CCK-8试剂盒检测皮质酮对脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导脾脏单个核细胞增殖的抑制；ELISA法检测皮质酮对LPS诱导脾脏单个核细胞分泌IL-6, TNF-a的抑制；Real time-PCR与Western-Blot法检测肺组织中糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor, GR) mRNA转录与GR蛋白表达水平。结果：1.皮质酮诱导法与多因素应激法建立的肾阳虚大鼠模型及肺肾气(阳)虚哮喘模型的对比研究：肾阳虚组在造模过程中均出现蜷缩、自主活动减少、大小便增多、体重明显下降、饮食水量异常等一般状态改变,结合OVA致敏,肺肾气(阳)虚哮喘组大鼠还表现出咳嗽、喷嚏、气喘等类似肺气虚哮喘的症状；与正常组比较,皮质酮肾阳虚组饮食水量明显减少(P<0.05),而应激肾阳虚组饮食水量明显增多(P<0.05)；与正常组比较,肾阳虚组、肺肾气(阳)虚哮喘组大鼠在旷场试验中总跨格数、水平运动、垂直运动明显减少(P<0.05),而肺气虚哮喘组总跨格数、垂直活动较正常组明显增加(P<0.05)；肾阳虚组、肺肾气(阳)虚哮喘组大鼠对糖水的偏爱显著下降(P<0.05),以应激肾阳虚组表现更加明显；与正常组比较,肾阳虚组胸腺萎缩(P<0.05),而OVA诱导各组胸腺、脾脏增生(P<0.05)；与正常组比较,皮质酮肾阳虚组肾上腺、甲状腺指数降低(P<0.05),睾丸指数升高(P<0.05),应激肾阳虚组肾上腺、甲状腺、睾丸指数均升高(P<0.05),肺气虚哮喘组肾上腺指数降低(P<0.05)；与正常组比较,皮质酮肾阳虚组大鼠血浆皮质酮、T4、TSH、LH、FSH水平均显著升高(P<0.05),而ACTH水平降低(P<0.05),应激肾阳虚组则不同,表现为上述激素水平均显著升高(P<0.05)：与正常组比较,各模型组cAMP/cGMP比值显著下降(P<0.05)；乙酰甲胆碱(Methacholine,Mch)浓度为12.5mg/mL、25mg/mL时,肺肾气(阳)虚哮喘组气道阻力(Airway resistance,RL)显著高于肺气虚哮喘组(P<0.05),其中以应激肺肾气(阳)虚哮喘组AHR最为明显；Bio-Plex检测结果显示OVA诱导组血清与BALF中致炎因子IL-6、IL-13水平显著高于无OVA诱导组(P<0.05),而抑炎因子IL-2、IL-10水平显著下降(P<0.05),其中致炎因子水平的升高以应激肺肾气(阳)虚哮喘组改变更加明显,抑炎因子水平的降低以皮质酮肺肾气(阳)虚哮喘组改变更加明显；肺组织病理结果提示肺肾气(阳)虚哮喘大鼠肺组织炎细胞浸润、粘液分泌及胶原沉积较肺气虚哮喘组更明显(P<0.05)。2.社交应激性“恐伤肾”致肾气虚组在造模过程中出现蜷缩、自主活动减少、饮食水减少及小便量增多等类似肾气虚的表现,肺气虚哮喘组、肺肾气虚哮喘组在OVA激发时,表现出咳嗽、呼吸频率加快、喷嚏、毛发干枯等肺气虚证表现；旷场试验结果显示,与正常组比较,肾气虚组、肺肾气虚哮喘组小鼠水平活动增加(P<0.05),粪便粒数增多(P<0.05),而在中央格的停留时间缩短(P<0.05),垂直活动减少(P<0.05)；肺功能结果显示,随着Mch浓度的增加,肺气虚哮喘组小鼠RL较正常组显著升高(P<0.05)。与肺气虚哮喘组比较,肺肾气虚哮喘组RL升高更加明显,但无统计学差异；与正常组相比,肺气虚哮喘组BALF中IL-4、IL-5、IL-6、IL-13与TNF-α水平显著升高(P<0.05),其中IL-4、 IL-5、IL-13与TNF-α水平肺肾气虚哮喘组高于肺气虚哮喘组(P<0.05)。与正常组相比,肺气虚哮喘组、肺肾气虚哮喘组血清中炎症因子IL-4、IL-5、IL-13与OVA-Ig E水平显著升高(P<0.05),其中肺肾气虚哮喘组血清中IL-4与IL-5水平明显高于肺气虚哮喘组(P<0.05)。而与正常组、肺气虚哮喘组比较,肾气虚组、肺肾气虚哮喘组血清皮质酮水平显著升高(P<0.05)；肺组织HE染色评分结果显示,与肺气虚哮喘组比较,肺肾气虚哮喘组周围支气管炎细胞浸润、水肿、上皮损伤更严重(P<.05); CCK-8结果显示,肾气虚组、肺肾气虚哮喘组小鼠体外LPS诱导的脾脏单个核细胞,其增殖不能被高浓度皮质酮所抑制,其中以肾气虚组最为明显；高浓度皮质酮不能抑制肺肾气虚哮喘组体外LPS诱导的脾脏单个核细胞分泌的IL-6、TNF-a水平；与正常组、肺气虚哮喘组比较,肾气虚组、肺肾气虚哮喘组小鼠肺组织GR mRNA转录与GR蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论：1.采用皮质酮诱导法、多因素复合应激法建立的肾阳虚模型,均存在类似临床上肾阳虚证的生物学表征改变、行为学异常、下丘脑-垂体-靶腺轴功能紊乱、交感-副交感神经功能紊乱,但在程度上有差异,从肾阳虚证的现代物质基础研究角度,以皮质酮诱导的肾阳虚证模型更加符合肾阳虚证患者的病生理改变。根据“疾病模型证候化”,采用OVA反复激发建立肺气虚哮喘模型,结合肾阳虚证造模方法建立的肺肾气(阳)虚哮喘模型,与肺气虚哮喘组比较,肺肾气(阳)虚哮喘组在AHR、气道炎症、气道重塑等方面表现更加严重,其中以多因素复合应激法建立的肺肾气(阳)虚哮喘模型改变更明显。2.利用啮齿类动物之间因领地占领进行的攻击,模拟“恐伤肾”建立肾气虚模型,该模型既表现出蜷缩、自主活动减少、小便增多等类似肾气虚的表现,又有HPA轴功能改变的生物学指标变化；根据“疾病模型证候化”,在OVA反复激发建立肺气虚哮喘模型的基础上,结合“恐伤肾”建立的肺肾气虚哮喘模型,具有类似肺肾气虚的生物学表征改变,又表现出AHR、气道炎症等类似人类哮喘的病生理特征,说明此方法建立的肺肾气虚哮喘模型具有可行性。与肺气虚哮喘模型比较,其AHR、气道炎症情况更严重,这与肺肾气虚哮喘组小鼠HPA轴激活,内源性皮质酮分泌增多相矛盾,机制研究表明可能与肺肾气虚哮喘组小鼠GR mRNA转录及GR蛋白表达下调,糖皮质激素敏感性下降有关。第四章补肾益气方药治疗肺肾气(阳)虚型哮喘的药效物质基础研究目的：利用HPLC-ESI/Q-TOF-MS/MS快速鉴别补肾防喘片中化学成分,结合动物实验研究,初步明确补肾益气方药治疗肺肾气(阳)虚型哮喘的活性成分。方法：1.补肾防喘片中化学成分鉴别：采用Agilent Poroshell 120-C18反相色谱柱,以乙腈-0.1%甲酸为流动相梯度洗脱；质谱使用ESI,在正离子、负离子、紫外线模式下采集数据。2.淫羊藿苷对社交应激性“恐伤肾”致肺肾气虚哮喘小鼠的干预作用及内在机制探讨：将45只Balb/c小鼠按随机数字法分为5组,每组9只,即正常组、“恐伤肾”致肺肾气虚哮喘组、地塞米松干预组、低剂量淫羊藿苷干预组、高剂量淫羊藿苷干预组。各用药组分别在OVA雾化前30min灌胃给药,连续14天。检测指标同第三章方法2。结果：1.通过正、负离子质谱信息及元素组成分析并结合对照品及相关文献数据对照,共鉴定出淫羊藿苷等18个化学成分；2.旷场试验结果显示,与肺肾气虚哮喘模型组比较,淫羊藿苷组小鼠中央格停留时间延长(P<0.05),垂直活动增加(P<0.05),水平运动、粪便次数明显减少(P<0.05),地塞米松干预亦有类似作用,但不如高剂量淫羊藿组改善明显；肺功能结果提示,与肺肾气虚哮喘组比较,淫羊藿苷与地塞米松干预组,在Mch高浓度激发时,RL明显下降(P<0.05),其中以高剂量淫羊藿苷RL下降最明显；淫羊藿昔与地塞米松治疗组可抑制肺肾气虚哮喘组血清及BALF中炎症因子水平的升高(P<0.05),高剂量淫羊藿苷与地塞米松作用相当或优于地塞米松,但两组之间无统计学差异；淫羊藿苷与地塞米松干预可抑制肺肾气虚哮喘组血清皮质酮水平升高(P<0.05)；淫羊藿苷与地塞米松干预可明显减轻肺肾气虚哮喘组气道炎细胞浸润、水肿、上皮损伤情况(P<0.05),其中以高剂量淫羊藿苷改善最明显；淫羊藿苷治疗组小鼠体外LPS诱导的脾脏单个核细胞增殖及分泌的细胞因子能被高浓度皮质酮所抑制,而地塞米松干预组此作用不明显；淫羊藿苷干预后肺组织GR mRNA与GR蛋白表达水平显著升高(P<0.01),呈剂量依赖性,而地塞米松治疗组有升高肺肾气虚哮喘组小鼠肺组织GR蛋白表达的趋势,但无统计学差异。结论：1.通过高效液相色谱分离,质谱测定相对分子质量及相关文献数据检索确定补肾防喘片中的18种化学成分,其中淫羊藿苷等5种单体成分来自补肾中药淫羊藿,这为阐明补肾益气方药的药效物质基础研究提供了证据。2.淫羊藿苷对肺肾气虚哮喘小鼠行为学、AHR、气道炎症等指标的改善作用呈剂量依赖性,并且高剂量淫羊藿苷作用优于地塞米松,其作用可能是通过调整HPA轴功能、调节免疫、上调GR mRNA转录及蛋白表达途径实现的,淫羊藿苷可能是补肾防喘片治疗肺肾气(阳)虚型哮喘的主要活性成分之一。