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目的:通过λRed重组系统构建鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene,spv)spv C敲除株STM-Δspv C,并利用原核表达载体p BAD/gⅢ构建spv C回补株STM-c-spv C。以鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium,S.typhimurium,STM)野生株STM-WT和所构建菌株作为受试菌,建立斑马鱼和He La细胞感染模型,研究spv C在感染过程中对宿主细胞自噬的影响,并探究其可能的作用机制,为通过调控细胞自噬来预防和控制沙门菌感染提供新的思路和方法。方法:一、沙门菌质粒毒力基因spv C敲除株和回补株的构建1.利用λRed重组系统构建spv C敲除株根据spv C基因上下游序列设计5’端含有spv C同源序列的引物,以质粒p KD4为模板,扩增得到两侧含FRT位点、中间为卡那霉素抗性基因的线性DNA片段。同时利用已电转入质粒p KD46的STM-WT菌株,经L-阿拉伯糖诱导表达重组蛋白,使其具有同源重组的能力。将线性DNA片段电转入具重组功能的感受态STM-WT菌株,利用卡那霉素平板筛选阳性转化子,随后利用表达Flp重组酶的质粒p CP20,将FRT位点之间的卡那霉素素抗性基因消除,用PCR鉴定阳性菌株。Western Blot检测沙门菌野生株STM-WT和spv C敲除株STM-Δspv C感染He La细胞后ERK磷酸化水平。2.沙门菌质粒毒力基因spv C回补株的构建根据Gene Bank中spv C基因的序列设计含有DNA限制性酶切位点(Xho I和Eco RI)序列的spv C特异性引物spv C-F(Xho I)和spv C-R(Eco RI),以鼠伤寒沙门菌野生株STM-WT全基因组DNA为模板,PCR扩增spv C基因序列DNA片段。将扩增得到的spv C DNA片段和原核表达载体p BAD/gⅢ分别用DNA限制性内切酶Xho I和Eco RI双酶切,然后将酶切产物在T4 DNA连接酶作用下定向连接。重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,PCR筛选阳性克隆并测序。将阳性重组质粒转化至STM-Δspv C,经L-阿拉伯糖诱导之后,收集菌体,提取蛋白,Western Blot检测Spv C蛋白的表达情况。二、沙门菌质粒毒力基因spv C对斑马鱼感染过程和自噬的影响由于鼠伤寒沙门菌回补株STM-c-spv C需要L-阿拉伯糖诱导,不适于斑马鱼感染实验,本部分研究以野生株STM-WT和spv C敲除株STM-Δspv C作为受试菌,以1×108 cfu/ml细菌量采用浸染法感染受精后5 d(days post fertilization,dpf)斑马鱼,感染后6 h(hours post infection,hpi)将斑马鱼转移到无菌Holtfreter buffer培养液中,分别在6、24、72、120 hpi收集斑马鱼进行实验。1.普通光学显微镜观察斑马鱼肠道形态学变化分别在不同时间点收集斑马鱼,无菌PBS洗3次,将斑马鱼置于倒置显微镜下观察不同感染组斑马鱼肠道形态学变化。2.活菌计数于不同感染时间点收集斑马鱼后,通过平板菌落计数法分别对斑马鱼全鱼和斑马鱼细胞内(利用阿米卡星杀死胞外菌)活菌进行计数。3.透射电子显微镜观察斑马鱼肠黏膜上皮细胞超微结构在72 hpi收集斑马鱼,透射电子显微镜下观察比较不同感染组斑马鱼肠道超微结构变化,并观察斑马鱼肠黏膜上皮细胞内自噬体的形成。4.Western Blot检测自噬相关蛋白Lc3和Beclin 1的表达水平收集不同感染时间点的斑马鱼,提取蛋白,Western Blot检测自噬相关蛋白Lc3和Beclin 1的表达。三、沙门菌质粒毒力基因spv C对He La细胞自噬的影响及机制探讨以鼠伤寒沙门菌野生株STM-WT、spv C敲除株STM-Δspv C和回补株STM-c-spv C作为受试菌,按感染复数(multiplicity of infection,MOI)100:1感染He La细胞,建立He La细胞感染模型,并以ERK抑制剂(PD0325901)干预,分别在感染后0.5 h、2 h和6 h收集细胞进行实验。1.瑞氏吉姆萨染色分析细菌与He La细胞的共作用分别在不同时间点收集细胞后,用PBS洗涤3,甲醇固定10 min,干燥,瑞氏吉姆萨染色。光镜下观察比较不同感染组细菌入侵、胞内增殖和感染细胞的状态。2.ERK抑制剂工作浓度的确定分别以0、5、10、20、50、100 n M ERK抑制剂(PD0325901)预处理He La细胞24 h,Western Blot检测ERK磷酸化水平,并用噻唑蓝还原法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)测定He La细胞存活率,以确定PD0325901的工作浓度。3.细胞内活菌计数平板菌落计数法计数不同感染组He La细胞内菌落形成单位(colony-forming unit,CFU),利用ERK抑制剂(PD0325901)干预,比较干预前后胞内CFU数目变化。4.Western Blot检测自噬相关蛋白LC3和Beclin 1的表达水平收集感染后细胞,提取细胞总蛋白,Western Blot检测不同感染组PD0325901处理前后自噬相关蛋白LC3与Beclin 1表达水平的变化。5.免疫荧光检测细菌与p62蛋白共定位收集感染后2 h的He La细胞,绿色荧光抗体标记p62蛋白,Hochest标记细菌和细胞核,激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)观察不同感染组经PD0325901处理前后p62蛋白与细菌共定位的情况。6.CLSM观察自LC3点状聚集利用稳定转染m RFP-GFP-LC3的He La细胞建立感染模型,感染2 h后收集细胞,Hochest标记细菌和细胞核,CLSM下观察LC3点状聚集和细菌与LC3共定位,比较不同感染组和PD0325901处理前后LC3点状聚集的变化。结果:一、沙门菌质粒毒力基因spv C敲除株和回补株的构建1.利用λRed重组系统构建spv C敲除株STM-Δspv CPCR鉴定结果显示沙门菌质粒毒力基因spv C被敲除,Western Blot检测spv C敲除株感染He La细胞后ERK磷酸化水平升高,证实了spv C敲除株STM-Δspv C的成功构建。2.沙门菌质粒毒力基因spv C回补株STM-c-spv C的构建PCR鉴定和测序结果显示p BAD-spv C重组质粒成功构建,转化入spv C敲除株STM-Δspv C后,经L-阿拉伯糖诱导,Western Blot检测到Spv C蛋白的表达。二、沙门菌质粒毒力基因spv C对斑马鱼感染过程和自噬的影响1.普通光学显微镜观察斑马鱼肠道形态学变化随着感染时间的延长,STM-WT和STM-Δspv C感染组与对照组相比斑马鱼肠腔均变狭窄,但在STM-WT感染组这种情况更为严重,在STM-WT感染组中肠道内容物模糊不清,肠腔内面积有所减少。2.活菌计数斑马鱼全鱼计数结果发现,随感染时间的延长STM-WT和STM-Δspv C感染组全鱼内活菌数均显著增加(P<0.001);斑马鱼细胞内活菌计数结果显示,在72 hpi侵入斑马鱼细胞内的STM-WT菌量显著高于STM-Δspv C菌量(P<0.05),且这种差异在120 hpi更加明显(P<0.001)。3.透射电子显微镜观察斑马鱼肠黏膜上皮细胞超微结构在72 hpi,STM-WT感染组斑马鱼肠黏膜微绒毛排列不整齐,有部分脱落,且肠腔内可见较多细菌;STM-Δspv C感染组肠黏膜微绒毛排列相对整齐,形态基本正常,未见脱落现象,肠腔内细菌数量相对较少。且在STM-Δspv C感染组斑马鱼肠黏膜上皮细胞内可见自噬体双层膜结构的自噬体。4.Western Blot检测自噬相关蛋白Lc3和Beclin 1的表达水平在24 hpi,STM-Δspv C感染组与STM-WT感染组相比,Lc3-II/Lc3-I比值和Beclin 1表达量升高(P<0.05),且这种差异在72 hpi更为明显(P<0.01)。三、沙门菌质粒毒力基因spv C对He La细胞自噬的影响及机制探讨1.瑞氏吉姆萨染色观察沙门菌与He La细胞的共作用瑞氏吉姆萨染色结果显示,感染后0.5 h沙门菌已侵入到He La细胞内,胞内有少量细菌,且细胞形态完好;感染后2 h胞内细菌数量明显增多,大部分细胞形态正常,少数细胞质松散,结构被破坏;感染后6 h部分细胞崩解,且这种情况在STM-WT和STM-c-spv C感染组更为明显。2.ERK抑制剂工作浓度的确定Western Blot结果发现,在50 n M和100 n M ERK抑制剂(PD0325901)作用下,He La细胞中ERK磷酸化得到较好地抑制。MTT实验结果显示,在50 n M PD0325901作用下,细胞存活率达70%。故将50 n M作为PD0325901的工作浓度干预He La细胞。3.细胞内活菌计数胞内CFU计数结果显示,在感染后0.5 h,各感染组间胞内CFU数没有显著差异;在感染后2 h和6 h,STM-Δspv C感染组胞内活菌数显著少于STM-WT和STM-c-spv C感染组(P<0.05)。PD0325901预处理后,在感染6 h,STM-Δspv C感染组与STM-WT感染组相比没有显著差异。4.Western Blot检测自噬相关蛋白LC3和Beclin 1的表达水平Western Blot结果发现,在感染后0.5 h和6 h,各感染组中LC3-II/LC3-I比值和Beclin 1蛋白表达量没有显著差别。在感染后2 h,STM-Δspv C感染组与STM-WT感染组相比,LC3-II/LC3-I比值和Beclin 1蛋白表达量均显著升高(P<0.05)。在PD0325901处理之后,这种升高均被抑制。5.免疫荧光检测沙门菌与p62蛋白共定位CLSM观察结果显示,STM-Δspv C感染组与STM-WT、STM-c-spv C感染组相比,p62点状聚集和胞内菌共定位数目增多(P<0.05)。在PD0325901处理之后,p62点状聚集和胞内菌共定位数目在各组间无明显差异。6.CLSM观察自噬体的形成CLSM观察结果发现在STM-Δspv C感染组,LC3黄色(自噬体)和红色(自噬溶酶体)点状聚集数均多于STM-WT和STM-c-spv C感染组,且LC3与胞内菌共定位数目也显著多于另两组(P<0.05)。PD0325901处理之后,各感染组LC3黄色和红色点状聚集物数均减少,且各组间没有显著差别。结论:1.利用λRed重组系统成功构建了鼠伤寒沙门菌spv C敲除株STM-Δspv C。2.利用原核表达载体p BAD/gⅢ成功构建了鼠伤寒沙门菌spv C回补株STM-c-spv C。3.鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spv C可以增强沙门菌毒力,加重斑马鱼感染和肠道病变,通过抑制斑马鱼自噬促进了沙门菌在斑马鱼体内的增殖和播散。4.鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spv C在感染早期可能通过ERK信号通路抑制宿主细胞自噬,并最终促进了胞内菌的增殖。