马尔堡病毒(Marburg Virus,MARV)是一种烈性病原体,感染人和非人灵长类动物可引起严重的急性出血热病。马尔堡病毒最早在1967年发现于德国马尔堡等地,并由此而得名。发现以来,在非洲多次爆发,共造成四百多人死亡,病死率高达88%。马尔堡病毒主要通过接触感染动物或病人的血液、分泌物、排泄物等体液,经破损的皮肤和粘膜传播。由于其传染性强和致死率高的特性,且目前国际上尚无临床批准的疫苗和治疗性药物,马尔堡病毒被认为是潜在的生物恐怖战剂,开展相关的研究对于防范生物恐怖袭击具有重大的军事和社会意义。2014年,与马尔堡病毒同属于丝状病毒科的埃博拉病毒在西非大肆流行,更引起人们对于丝状病毒的高度关注。单克隆抗体由于其特异性好、可以在暴露后起到治疗效果,被认为是很有前景的治疗药物。近年来人源化及全人源抗体制备技术蓬勃发展,克服了传统的鼠源抗体半衰期短、免疫原性高等缺点,极大地推动了单克隆抗体在临床治疗中的应用。目前制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术、噬菌体抗体库技术、单细胞PCR技术、核糖体展示技术等,其中单细胞PCR技术可以直接从单个B细胞中扩增抗体基因,具有快速、高通量、保持轻重链天然配对的优点,是最新、最高效的抗体筛选方法之一。本实验室基于流式分选技术和单细胞PCR技术构建了全人源单克隆抗体的快速筛选平台,从疫苗免疫志愿者或康复期患者的免疫细胞中扩增自然配对的抗体基因,最快能够在一周内筛选获得有效抗体。本研究基于该平台进行优化,建立了从恒河猴记忆B细胞中筛选中和抗体的方法,当面临新发突发传染病,无获批疫苗免疫志愿者、也没有康复者提供免疫细胞用于筛选高效价中和抗体的情况时,利用该方法可迅速获得候选中和抗体用于临床研究,补充和完善了抗体筛选平台,为应对其他病原体提供了技术储备。首先我们对两只成年恒河猴进行四次重组5型腺病毒载体马尔堡病毒病疫苗候选株(rAd5-MAGPopt)免疫和一次蛋白加强免疫,采集每次免疫当天及免疫后7 d、14 d、28 d的血清样本,通过ELISA和假病毒中和实验检测不同时间点的血清中MARV GP特异抗体和中和抗体水平。结果表明,免疫后两到三周血清MARV GP结合抗体滴度明显升高,且对假病毒表现出明显的中和活性,说明在恒河猴体内激发了有效的体液免疫反应,为分选中和抗体提供了保证。为了扩增恒河猴的抗体基因,我们尝试了不同的细胞分选策略和反转录PCR体系,最后采用分选抗体分泌细胞/抗原特异性记忆B细胞、SuperScriptⅢ反转录体系、多重引物组合的巢式PCR的方法,成功从恒河猴单个B细胞中扩增得到抗体基因。从恒河猴五免二周的血液样本中分离得到外周血单个核细胞,用荧光抗体对细胞进行染色,利用流式细胞分选仪分选得到768个抗体分泌细胞和1344个抗原特异性记忆B细胞。经过反转录PCR和巢式PCR,分别扩增得到116对和336对配对的抗体轻重链基因,阳性率分别为15.1%和25%。对抗体基因进行测序分析,发现抗体基因多样性好、无重复克隆。为了对抗体功能进行研究,我们分别在哺乳动物细胞表达系统和昆虫细胞表达系统表达了MARV GPΔTM和MARV GPΔmuc蛋白,为抗体的筛选提供了有效的实验材料。经过重叠延伸PCR,对轻重链配对的抗体基因构建了包含启动子-前导序列、抗体可变区基因、抗体恒定区基因、多聚A尾片段的线性表达框,通过转染HEK293T细胞,可以实现快速、高通量地表达抗体。经过ELISA方法筛选,得到了79株结合抗体。我们对具有结合活性的抗体构建了表达载体,对抗体进行了表达和纯化,进一步检验了它们的中和活性,发现有两株抗体2H5和3H5可以在100μg/mL的浓度下,分别对假病毒起到73%和79%的中和作用。综上所述,本文建立了基于流式分选-单细胞PCR技术的筛选猴源单克隆抗体的方法,为应对新发突发传染病提供了技术储备;筛选获得了多株MARV结合单抗和两株具有中和活性的猴源单抗,该抗体可进一步研究用作马尔堡病毒“鸡尾酒疗法”的候选抗体。